疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因（gla）的克隆及在毕赤酵母中的表达

本研究以疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）cDNA为模板,克隆了糖化酶基因（gla）,序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成,编码617个氨基酸。根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64kD,属于糖苷水解酶第15家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增gla的成熟蛋白编码基因,构建表达载体,经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastorisGS115）,并成功进行了表达。重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67kD,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关。该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温20min后剩余酶活为54%。