Generierung und Charakterisierung rekombinanter TNF-Liganden

Liganden und Rezeptoren der TNF-Familie regulieren eine Vielzahl zellularer Prozesse, darunter Apoptose und Immunprozesse. TNF-Liganden kommen in Form loslicher und membranstandiger trimerer Molekule vor, wobei die trimere Organisation durch die konservierte THD vermittelt wird. Im Gegensatz zu den membranstandigen Molekulen konnen losliche TNF-Liganden nicht immer an ihren TNF-Rezeptor binden oder ihn effektiv aktivieren. Fur zwei solcher inaktiven TNF-Liganden, namlich TRAIL und CD95L, konnte gezeigt werden, dass durch sekundare Oligomerisierung oder durch artifizielle Herstellung einer Membranstandigkeit mittels Antikorperdomanen gegen zelloberflachenexprimierte Proteine hochaktive Ligandenvarianten generiert werden konnen. Inwieweit sich diese Verfahren auf die T-Zell-kostimulatorischen TNF-Liganden OX40L, 41BBL und CD27L ubertragen lassen, wurde in dieser Arbeit untersucht. Losliche Flag- und Flag-TNC-Varianten von OX40L und 41BBL zeigten eine gute Bindung an die Rezeptoren OX40 und 41BB. Die losliche Variante Flag-CD27L konnte nicht an ihren Rezeptor CD27 binden. Dies war aber nach Einfuhrung der trimerstabilisierenden TNC-Domane moglich. Eine effektive Aktivierung ihres Rezeptors, nachgewiesen durch Analyse der IL8-Induktion, bewirkten die loslichen TNF-Ligandenvarianten nur nach sekundarer Oligomerisierung mittels des Flag-spezifischen Antikorpers M2. Eine ahnlich gute TNFR-Aktivierung lies sich durch Einfuhrung der hexamerisierenden Fc-Domane erzielen. Fc-Flag-OX40L und Fc-Flag-41BBL induzierten bereits ohne sekundare Quervernetzung effektiv IL8. Die Hexamerisierung alleine reichte fur die losliche CD27L-Variante nicht aus, hier war zusatzlich zur Fc- wiederum auch die TNC-Domane erforderlich, um die Bindung an CD27 und eine schwache IL8-Induktion zu erzielen. Fur die FAP-bindenden Fusionsproteine antiFAP-Flag- OX40L, antiFAP-Flag-41BBL und antiFAP-Flag-TNC-CD27L war die Bindung an OX40, 41BB und CD27 sowie an FAP nachweisbar. Erst durch die artifizielle Membranstandigkeit nach Bindung an FAP konnten diese Fusionsproteine uber ihren Rezeptor effektiv IL8 induzieren. Zusammenfassend lies sich somit zeigen, dass sich schwach oder nicht aktive losliche Ligandenvarianten von OX40L und 41BBL durch sekundare Oligomerisierung, durch die Fc-Hexamerisierungsdomane und durch artifizielle Membranstandigkeit in hochaktive Liganden verwandeln lassen. Losliche CD27L-Varianten benotigen zusatzlich die trimerstabilisierende TNC-Domane, um CD27 binden und aktivieren zu konnen. Fur das bessere Verstandnis der Ligand-Rezeptor-Interaktionen wurden zusatzlich OX40L-, 41BBL- und CD27L-Fusionsproteine mit der hochaktiven Gaussia princeps Luziferase (GpL) generiert, um Gleichgewichtsbindungs-, Dissoziationsstudien und homologe Kompetitionsassays durchfuhren zu konnen. Fur die Fusionsproteine GpL-Flag-TNC-OX40L, GpL-Flag-TNC-41BBL und GpL-Flag-TNC-CD27L konnte gezeigt werden, dass die IL8-Induktion nicht von der Rezeptorbelegung abhangt, sondern von der sekundaren Oligomerisierung, da bei gleicher Rezeptorbelegung durch sekundar quervernetzte TNF-Liganden mehr IL8 induziert wird, die Rezeptoraktivierung also qualitativ besser sein muss.