Etude biochimique des récepteurs aux goûts sucré et umami : Rôle des domaines N-terminaux et caractérisation d'un inhibiteur spécifique, la gurmarine

Le recepteur au gout sucre est un heterodimere compose des sous-unites T1R2 et T1R3, alors que les sous-unites T1R1 et T1R3 s’assemblent pour composer le recepteur au gout umami. Chacune de ces sous-unites appartient a la classe C des recepteurs couples aux proteines G (RCPG). Les membres de cette famille partagent une architecture commune, constituee d’un domaine N-terminal (DNT) qui est relie a un domaine transmembranaire par une region riche en cysteines. Le DNT est constitue de deux lobes qui forment le site orthosterique, qui est le site de liaison des principaux agonistes. Il a ete montre que les DNT de T1R1 (DNT-T1R1) est capable de lier le L-glutamate alors que le DNT de T1R2 (DNT-T1R2) est capable de lier les sucres naturels et certains edulcorants (Zhang et al., 2008 ; Nie et al., 2005). Cependant les mecanismes moleculaires de detections des molecules sapides au niveau de ces domaines restent encore largement meconnus. Lors de cette etude, nous avons exprime les DNT-T1R1, DNT-T1R2 humains et le DNT-T1R1 de souris a l’aide de la bacterie Escherichia coli, sous forme de proteines insolubles, appeles corps d’inclusion (CI). Les CI ont ete purifies puis solubilises en utilisant un agent chaotrope. Ensuite, les proteines ont ete repliees in vitro puis caracterisees par differentes approches parmi lesquelles l’electrophorese, la filtration sur gel, la fluorescence et le dichroisme circulaire. Leur fonctionnalite a ensuite ete verifiee par microcalorimetrie de titration isotherme. Nous avons montre que les proteines sont fonctionnelles et presentent des affinites en accord avec les donnees sensorielles. Les grandes quantites de proteines produites permettront de futures etudes structurales par cristallographie. Parallelement a ce travail, nous avons etudie un polypeptide vegetal, inhibiteur des gouts sucre et umami chez les rongeurs, appele gurmarine. Afin de pouvoir etudier son interaction avec les DNT des recepteurs gustatifs de souris, nous avons mis au point l’expression et la purification de gurmarine recombinante produite en levure Pichia pastoris. Ce systeme d’expression a permis la production de quantites importantes de gurmarine dont les caracteristiques structurales ont ete verifiees par dichroisme circulaire et resonnance magnetique nucleaire. Nous avons aussi, par mutagenese dirigee, modifie differents acides amines decrits comme etant potentiellement impliques dans l’interaction avec les recepteurs aux gouts sucre et umami. En collaboration, l’activite de la gurmarine a ete confirmee a l’aide d’un test cellulaire base sur l’expression fonctionnelle du recepteur de rat T1R2/T1R3. A l’aide de differentes combinaisons des sous-unites humaines et de rongeurs, nous avons montre que l’inhibition par la gurmarine necessitait la presence de la sous-unite T1R3 de rat.