Analyse des Antisigmafaktors Rsd aus E. coli: Charakterisierung von Bindungspartnern, Einfluss von Rsd auf die Transkription und Regulation des rsd-Gens

Das kleine Protein Rsd ist ein Antisigmafaktor fur σ70, den Hauptsigmafaktor in E. coli. Beim Ubergang in die stationare Phase bindet Rsd an σ70 und verhindert so die Bildung des Eσ70 Holoenzyms. Dadurch verbessert sich die Moglichkeit der Bindung des alternativen Sigmafaktors σ38 an das Coreenzym der RNAP und fur eine Initiation der Transkription σ38-abhangiger Gene. Mittels Retardierungsanalysen und in vitro Transkriptionen wurde die Sigmafaktorspezifitat von Rsd in vitro untersucht. Dabei zeigte sich, dass bei den Bindungsstudien Rsd beide Holoenzyme inhibieren kann. Erst bei in vitro Transkriptionen zeigte sich eine selektive Inhibierung des Eσ70 Holoenzyms, wahrend die Aktivitat des Eσ38 Holoenzyms nicht beeintrachtigt wurde. Bei einer in vitro Transkription unter Sigmakompetitionsbedingungen um die Bindung an das Coreenzym, konnte erstmalig die Inhibierung der σ70-abhangigen Transkription bei gleichzeitiger Aktivierung der σ38-abhangigen Transkription direkt gezeigt werden. Mittels affinity-binding Experimenten konnte eine Bindung von Rsd an σ38 nachgewiesen werden. Allerdings ergaben sich keine Hinweise auf die Bildung eines stabilen Rsd-RNAP-Komplexes. Mit Hilfe von Primer-Extension Analysen wurde der Einfluss von Rsd auf einige σ70 und σ38-abhangige Promotoren in vivo untersucht. Dabei konnte beobachtet werden, dass Rsd die Transkription von σ38-abhangigen Promotoren in der stationaren Phase aktiviert. Eine Inhibierung von σ70-abhangigen Promotoren wurde jedoch nicht gefunden. Den zweiten Teil dieser Arbeit bildete die Analyse der rsd-Expression. Die Transkription des rsd-Gens wird durch zwei Promotoren gesteuert, den σ38-abhangigen P1 Promotor, der in der stationaren Phase aktiv ist und den σ70-abhangigen P2 Promotor der konstitutiv uber die Wachstumsphasen exprimiert wird. Mittels Bindungsstudien wurde in vitro der Einfluss der Nucleoid-assoziierten Proteine H-NS, StpA, LPR und FIS untersucht. Dabei wurden Bindestellen der Proteine H-NS und StpA im Bereich des P2 Promotors und fur FIS am P1 Promotor gefunden. Zusatzlich konnten Bindestellen von LRP und StpA im rsd-Gen nachgewiesen werden. Bei in vivo Analysen zeigte sich allerdings eine Derepression der rsd-Promotoren nur fur die Proteine H NS und FIS. Dafur wurden Hinweise darauf gefunden, dass die rsd-Expression abhangig von der Methylierung der DNA ist. Weiterhin ergaben sich Hinweise auf eine Autoregulation von Rsd. Zwar scheint Rsd nicht stringent reguliert zu werden, dennoch gibt es deutliche in vivo und in vitro Effekt von DksA auf die rsd-Expression.