Nuevos aspectos clínicos, bioquímicos, genéticos y terapéuticos en las encefalomiopatías mitocondriales en edad pediátrica

HIPOTESIS El estudio holistico (clinico, bioquimico, genetico y terapeutico) de las encefalomiopatias mitocondriales en la infancia aportara nuevo datos sobre aspectos fenotipicos, diagnosticos y de tratamiento en estos pacientes. La importancia de una buena clasificacion etiologica de los pacientes radica en la posibilidad de implantar tratamientos especificos que pueden mejorar la evolucion del cuadro clinico. OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis es aplicar el conocimiento clinico, bioquimico, patologico y molecular para una identificacion rapida de pacientes con encefalomiopatia mitocondrial que pueda permitir, no solo su clasificacion etiologica con un mejor conocimiento de la enfermedad, sino la implantacion de tratamientos especificos de forma precoz. Los objetivos concretos son los siguientes: 1. Describir nuevos fenotipos asociados a mutaciones puntuales en ADNmt previamente reportadas y fenotipos ya conocidos asociados a mutaciones puntuales en ADNmt previamente no reportadas. 2. Validar nuevos metodos no invasivos para el diagnostico de encefalomiopatias mitocondriales debidas a mutaciones puntuales en ADNmt estudiando el porcentaje de mutacion en diferentes tejidos. 3. Evaluar la eficacia de nuevos tratamientos en pacientes afectos de encefalomiopatias mitocondriales por medio del estudio de la repuesta a la suplementacion con acido folinico en pacientes afectos de KSS causado por delecion del ADNmt que presentan asociado deficit de folato en LCR. RESULTADOS 1. Descripcion de nuevos fenotipos y nuevas mutaciones puntuales en ADNmt - Se ha reportado por primera vez la mutacion m.5514A>G en MT-TW de ARNtTrp en homoplasmia como posible causante de encefalomiopatia mitocondrial en un neonato. - Se ha reportado por primera vez la mutacion m.1643A>G en gen MT-TV de ARNtVal en homoplasmia como posible causante de encefalomiopatia mitocondrial en una lactante de 2 anos de edad con estatus epileptico. - Se ha descrito por primera vez la asociacion del fenotipo MERRF a la mutacion m.15923A>G en gen MT-TT de ARNtThr en heteroplasmia. 2. Validacion de nuevos metodos no invasivos para el diagnostico de encefalomiopatias mitocondriales debidas a mutaciones puntuales en ADNmt 2.1. Descripcion de fenotipos clinicos - Se han reportado los signos clinicos y sintomas de 19 miembros de una familia con mutacion m.3243>G en gen MT-TL1 de ARNtLeu. - Se han reportado los signos clinicos y sintomas, los estudios metabolicos, radiologicos y la histopatologia de 6 casos, sus respetivas madres y de 2 hermanos con mutaciones puntuales en ADNmt. - Se ha descrito por primera vez la asociacion del fenotipo NARP a la mutacion m.13513G>A en gen MT-ND5 en heteroplasmia. - Se ha descrito por primera vez la asociacion del fenotipo NARP a la mutacion m.9176T>C en gen MT-ATP6 en heteroplasmia. 2.2. Comparacion del porcentaje de mutacion en diferentes tejidos - Se ha confirmado que la orina presenta mayor porcentaje de mutacion m.3243A>G en gen MT-TL1 de ARNtLeu respecto a la sangre y la mucosa oral en 13 miembros de una familia con pacientes afectos de MELAS, pacientes con formas pauci u oligosintomaticas y casos asintomaticos (t student, p valor < 0.01). - Se ha observado que la orina presenta mayor porcentaje de mutacion respecto a la sangre y la mucosa oral en los casos de mutaciones puntuales en otros genes de ARNt-mt: m.3252A>G en gen MT-TL1 de ARNtLeu, m.15923A>G en gen MT-TT de ARNtThr y en mutaciones puntuales en genes implicados en la codificacion de subunidades de complejos del sistema OXPHOS: m.13513G>A en gen MT-ND5 y m.8993T>G, m.9176T>C en gen MT-ATP6. - Se ha demostrado en toda la cohorte de casos que la orina presenta mayor porcentaje de mutacion puntual en ADNmt respecto a la sangre y la mucosa oral (t student, p valor < 0.01). 2.3. Comparacion del grado de heteroplasmia (porcentaje de mutacion) en cada tejido entre los pacientes sintomaticos y asintomaticos - Se ha demostrado en toda la cohorte de casos con mutaciones puntuales de ADNmt que el porcentaje de mutacion es mayor en los casos sintomaticos que en los asintomaticos tanto en orina, sangre como en mucosa oral (test de Levene y t student, p valor < 0.05, para todos los tipos de muestra) - En 12 casos asintomaticos de toda la cohorte se ha encontrado que la orina presenta un grado de heteroplasmia de la mutacion en ADNmt mayor al 5%. 2.4. Correlacion del grado de heteroplasmia (porcentaje de mutacion) en cada tejido con la edad - Se ha demostrado en toda la cohorte de casos que el porcentaje de mutacion en orina, sangre y mucosa oral se correlaciona negativamente con la edad (coeficiente de correlacion de Pearson: r = - 0.549, r = - 0.646, r = - 0.634, respectivamente). 3. Evaluacion de la eficacia de nuevos tratamientos en pacientes afectos de encefalomiopatias mitocondriales - No se han reportado efectos adversos secundarios a la suplementacion con acido folinico en ninguno de los casos. - La deficiencia de 5-MTHF en LCR se ha reportado en todos los casos en condiciones basales. - Se ha observado una recuperacion de los niveles de 5-MTHF en LCR hasta valores normales en los 3 pacientes que aceptaron repetir la puncion lumbar despues de un periodo de suplementacion con acido folinico. - En 2 casos se ha constatado una mejoria de la clinica neurologica (seccion III de la NPMDS y la NMDAS) tras la suplementacion con acido folinico. En los otros casos se ha constatado un empeoramiento neurologico. - Se ha realizado estudio de neuroimagen en 6 casos tras un periodo de suplementacion con acido folinico. Un paciente presento recuperacion de las lesiones de la sustancia blanca. Los demas casos presentaron progresion de las lesiones en la sustancia blanca subcortical, las lesiones en cerebelo y la atrofia cerebral. CONCLUSIONES 1. En los 3 casos descritos con encefalomiopatia mitocondrial, hemos utilizado una aproximacion diagnostica clinica basada en los criterios diagnosticos de enfermedad mitocondrial de Morava y en la edad de inicio de aparicion de los sintomas. Esta aproximacion diagnostica clinica ha sido util como metodo de estudio de los pacientes con sospecha de encefalomiopatia mitocondrial. 2. En el proceso de diagnostico molecular de los pacientes con mutaciones puntuales del ADNmt, hemos utilizado los criterios establecidos de patogenicidad de las mutaciones del ADNmt y de los ARNt-mt para definir la patogenicidad de las nuevas mutaciones descritas en esta tesis. Dichos criterios son utiles como herramienta fundamental para el diagnostico molecular de pacientes con sospecha de encefalomiopatia mitocondrial y mutaciones nuevas en ADNmt. 3. No obstante, a pesar de que los criterios de patogenicidad de las mutaciones del ADNmt y de los ARNt-mt estan bien establecidos, hemos demostrado que mutaciones homoplasmicas en los ARNt-mt pueden ser patogenicas y producir encefalomiopatias mitocondriales. 4. En pacientes pediatricos con encefalomiopatias mitocondriales, la orina es la muestra de eleccion para el diagnostico molecular rapido y no invasivo de mutaciones puntuales del ADNmt, no solo para mutaciones puntuales en los genes ARNt-mt, sino tambien para mutaciones en genes que codifican subunidades de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial. 5. Proponemos el analisis del grado de heteroplasmia de mutaciones puntuales del ADNmt en orina de familiares oligo o asintomaticos (incluyendo mujeres asintomaticas en edad fertil) de pacientes con encefalomiopatia mitocondrial como metodo de eleccion para determinar el posible riesgo de desarrollar y transmitir la enfermedad. 6. Hemos demostrado que la suplementacion via oral con acido folinico en los pacientes con sindrome de Kearns-Sayre se debe realizar en edades tempranas y a dosis altas (3 mg/kg/dia) para intentar frenar la progresion de la sintomatologia neurologica, en especial en lo concerniente a las lesiones de la sustancia blanca cerebral.