Identificação e caracterização parcial de antígenos isolados de vacinas contra Leishmaniose tegumentar americana (Leishvacin )

Este trabalho baseou-se na ideia de se isolar antigenos de vacinas contra Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), armazenadas por longos periodos, (Leishvacin). Estas vacinas apresentam alto grau de degradacao em funcao dos anos de armazenamento, mas sao ainda capazes de induzir protecao contra a leishmaniose tegumentar em humanos, apesar de terem sido estocadas por periodos acima de cinco anos.Antigenos foram isolados de amostras de vacina polivalente, constituidas por cinco diferentes linhagens dermotropicas de Leishmania, e de amostras de vacina monovalente constituida pela linhagem do parasito Leishmania amazonensis, por dois diferentes metodos de fracionamento (dialise e cromatografia). Pelo metodo de dialise foram isolados antigenos de quatro das cinco linhagens de Leishmania presentes na vacina polivalente (Leishmania (L) amazonensis, Leishmania (L) mexicana, e duas linhagens de Leishmania major-like). Estes antigenos sao capazes de discriminar soros de individuos americanos e de caes infectados com a forma visceral da doenca (LVA) de soros de individuos infectados com a forma tegumentar da doenca (LTA), ou de individuos saudaveis. Estes antigenos foram tambem isolados de amostras de vacina fresca constituida por L amazonensis, indicando que sua formacao e independente do tempo de estocagem das vacinas. Tais antigenos sao formados por fenomenos complexos de agregacao molecular de pequenas moleculas, apresentando peso molecular na faixa de 106 KDa, tendo sido obtidos tanto no dialisado das vacinas quanto na fracao nao dialisada.Por cromatografias de exclusao molecular foram isolados antigenos da fracao soluvel da vacina polivalente (antigeno PI) e de vacina monovalente da linhagem Leishmania (L) amazonensis, cepa PH8 do parasito (antigeno P8). Assim como os antigenos obtidos no dialisado e na fracao nao dialisavel destas vacinas, PI e P8 sao tambem antigenos formados por fenomenos de agregacao molecular de pequenas moleculas, independente do tempo de armazenamento das vacinas. Estes antigenos sao tambem especificamente reconhecidos pelo soro de humanos e de caes com LVA, mas nao pelo soro de individuos normais ou infectados com outras formas da leishmaniose ou com outras doencas. Nao ha reatividade cruzada destes antigenos com soro de individuos com doenca de Chagas, seja em ensaios de Elisa ou em ensaios de western blot. PI e P8 sao moleculas de peso molecular na faixa de 106 KDa, assim como os antigenos obtidos pelo fracionamento da vacina por metodos de dialise.Analises dos antigenos PI e P8 por metodos quimicos e fisicos indicam que estes antigenos nao apresentam material de natureza proteica ou acidos nucleicos na sua composicao. A analise direta por metodos quantitativos confirmam a ausencia de proteinas na composicao dos antigenos. Por outro lado, tanto a analise por metodos quimicos quanto a analise por metodos de analise quantitativos confirmam que PI e P8 sao antigenos de carboidrato. PI e P8 sao sensiveis ao tratamento por agentes quimicos como o dodecil sulfato de sodio (SDS), 2-mercaptoetanol e o acido periodico, sendo que os dois ultimos agentes sao capazes de abolir por completo a reatividade destes antigenos com o soro de humanos e de caes com LVA. Nossos estudos indicam que os tres reagentes agem na estrutura destes antigenos dissociando-os em seus componentes de menor peso molecular, porem a desagregacao ocorre por mecanismos distintos de acordo com o reagente utilizado. Os resultados indicam que o SDS age desestabilizando interacoes ionicas na estrutura dos antigenos, enquanto o 2-mercaptoetanol age, provavelmente, rompendo ligacoes quimicas intra ou intermoleculares nos antigenos. Os resultados tambem indicam que o 2-mercaptoetanol nao promove o rompimento de ligacoes glicosidicas, sendo que a perda da capacidade dos antigenos de reagirem com os soros de individuos com LVA envolve alteracoes na conformacao dos antigenos, sendo estes antigenos PI e P8 provavelmente formados por epitopos conformacionais.Analises em eletroforese e por cromatografia de fase reversa indicam que PI e P8 sao formados pela agregacao de moleculas de peso molecular (PM) em torno de 2,50 KDa. Os resultados obtidos por fase reversa descartam a presenca de acidos graxos ou de lipideos na composicao quimica dos antigenos. Finalmente, analises por metodos de cromatografia em camada delgada confirmam que PI e P8 sao antigenos de carboidrato. PI e P8 sao constituidos por glicose, galactose, manose e, possivelmente, apresentam na sua composicao derivados de acucares como fosfoacucares, aminoacucares e sulfoacucares.Os resultados aqui apresentados indicam que as vacinas, objeto deste estudo, sofrem alteracoes consideraveis em sua composicao quimica sendo as mais relevantes: i) o alto grau de degradacao de moleculas gerando moleculas de menor PM, ii) formacao de antigenos de alto PM por fenomenos de agregacao molecular, ii) o reconhecimento destes antigenos por soro de individuos com LVA mas nao por soro de individuos com LTA, iv) o fato destes antigenos agregados serem essencialmente constituidos de carboidrato.