人microRNA-21真核过表达载体的构建及其在HepG2.2.15细胞中上调c-myc基因的表达

目的构建人微小RNA-21（microRNA-21,miRNA-21）真核过表达载体pmR-21,探讨其在HepG2.2.15细胞中对c-myc基因表达的调控作用。方法 PCR扩增miRNA-21的前体基因片段（pre-miRNA-21）,双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到HepG2.2.15细胞中为实验组,另设空载体组（转染pmRmCherry空质粒组）,空白组（未转染组）,阳性对照组（HepG2细胞）,24h后观察载体荧光蛋白表达情况,流式细胞术检测转染效率,实时荧光定量PCR评估miRNA-21的表达情况;转染72h后,RT-PCR和Western blot检测c-myc mRNA及蛋白表达水平;CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果经双酶切和测序验证,目的基因片段插入载体中;实验组及空载体组转染24h后细胞内可见强荧光,转染效率大于50%;实验组细胞miRNA-21表达较空载体组、空白组水平升高;转染72h后实验组细胞c-myc mRNA表达较空载体组、空白组升高;实验组细胞增殖快于空载体组及空白组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建miRNA-21真核过表达载体pmR-21,该重组载体可稳定表达miRNA-21;miRNA-21可上调c-myc基因的表达,c-myc基因是miRNA-21发挥促癌作用的靶点之一。