A MANUTENÇÃO DE Ehrlichia canis EM MACRÓFAGOS É DEPENDENTE DA EVASÃO LISOSSOMAL / THE MAINTENANCE OF Ehrlichia canis IN MACROPHAGES IS DEPENDENT ON LYSOSOMAL EVASION

Ehrlichia canis e o agente etiologico de Erliquiose Monocitica Canina (EMC), uma das mais importantes doencas infecciosas de caes no Brasil. Bacterias intracelulares obrigatorias de monocitos e macrofagos, como E. canis , desenvolvem diversos mecanismos celulares para assegurar a sua evasao das defesas do hospedeiro, que envolvem distintas adaptacoes para sobrevivencia nos compartimentos intracelulares. No entanto, estudos sobre essas estrategias ainda sao escassos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo investigar se a E. canis possui a capacidade de evitar a fusao de lisossomos as inclusoes citoplasmaticas, o que favoreceria sua multiplicacao. A fusao de lisossomos com endossomos contendo E. canis foi investigada utilizando cultivo celular de histiocitos caninos (DH82) infectados com a cepa Sao Paulo de E. canis , em uma momento no qual 50% das celulas estavam parasitadas. Para esse fim as celulas infectadas foram marcadas citoquimicamente para fosfatase acida, uma enzima presente nos compartimentos fusionados a lisossomos. Apos o processo de inclusao em resina, os cortes ultrafinos foram analisados ​​e documentados fotograficamente em um microscopio eletronico de transmissao . Foram reazaliadas comparacoes entre tres pares de controle e grupos experimentais em relacao a numero de bacterias por celula, numero de lisossomos marcados por celula e numero de vacuolos marcados contendo E. canis por celula. A analise estatistica foi realizada pelo teste de Mann-Whitney, sendo considerados significativos valores p<0,05. A marcacao citoquimica da enzima lisossomal nao foi observada em vacuolos contendo E. canis integras indicando que essas bacterias sao capazes de inibir a fusao lisossomal aos endossomos, como um mecanismo de evasao imune. A evasao da fusao lisossomal por inclusoes erliquiais e fundamental para a sobrevivencia e reproducao do patogeno, apesar de ser baseado em diferentes estrategias de acordo para as especies de Ehrlichia spp. A demonstracao da evasao lisossomal durante a propagacao de E. canis serve como base para o desenvolvimento e elaboracao de novas estrategias terapeuticas.  SUMMARY Ehrlichia canis is the etiologic agent of canine monocytic ehrlichiosis (CME), one of the most important infectious diseases of dogs in Brazil. Obligate intracellular bacteria of monocytes and macrophages like E. canis develop various cellular mechanisms to avoid host defenses, which involve different adaptations for survival in intracellular compartments. However, studies about these strategies are scarce. Thus, the present study aimed to investigate whether E. canis has the ability to prevent the fusion of lysosomes to cytoplasmic inclusions, which would favor its multiplication. The fusion of lysosomes with endosomes containing E. canis was investigated using cell culture of canine histiocytes (DH82) infected with the Sao Paulo strain of E. canis when 50% of the cells were parasitized. To this end, infected cells were cytochemistrically labeled for acid phosphatase, an enzyme present in the fused lysosome compartments. After resin embedding process, the ultrathin sections were analyzed and photographically documented in a transmission electron microscope (TEM). We compared three control pairs and experimental groups in relation to the number of bacteria per cell, number lysosomes marked per cell and the number of labeled vacuoles containing E. canis per cell. Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney test, at p<0.05 significance level. The cytochemical staining of the lysosomal enzyme was not observed in vacuoles containing intact E. canis indicating that these bacteria are able to inhibit lysosomal fusion to endosomes, as a mechanism of immune evasion. The evasion of lysosomal fusion by erlichia inclusions is critical to the survival and reproduction of the pathogen, despite being based on different strategies according to the species of Ehrlichia spp. Demonstration of lysosomal escape during the propagation of E. canis serves as a basis for the development and design of new therapeutic strategies.