NF-κB启动子调控的pNF-κB-IRES2-EGFP-p27双顺反子真核表达载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定携带核转录因子KB（nuclearfactoκB，NF—κB）特异性启动子的Flagp27和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）双顺反子真核表达载体pNF-κB-IRES2-EGFPp27，转染经H202干预的人脐静脉内皮细胞（humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs），观察其表达。方法采用基因工程技术，经过多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的NF-κB特异性启动子双转基因真核表达载体。转染体外培养的经H2O2干预的HUVEs，观察EGFP的表达，并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27基因的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定，成功地构建真核表达载体pNF-κB—IRES2-EGFP-p27，转染经H2O2干预的HUVEs后，可见部分细胞有EGFP的表达，并且在EGFP阳性的细胞中p27基因的表达水平明显增高，而未经H2O2处理的对照组转染pNF-κB-IRES2-EGFP-p27后无EGFP的表达。结论NF-κB启动子能够特异性地激活p27基因的表达。EGFP基因可以指示p27基因的表达情况。由NF-κB特异性启动子启动的p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功（chronic graft dysfunction，CGD）之间的关系，并为进一步寻找慢性移植物失功的基因治疗途径奠定基础。