Investigating complex carbon degradation in a beech forest soil and first insights into the application of single-cell methods to detect active microorganisms in soil systems

Terrestrische Okosysteme beherbergen einen Grosteil des auf der Erde vorkommenden Kohlenstoffs (C). Totes Pflanzenmaterial, das hauptsachlich aus Zellulose besteht, ist die Hauptquelle dieses Kohlenstoffs. Bakterien und Pilze sind die Hauptakteure im Abbau dieses Kohlenstoffreservoires. Wir stellten die Hypothese auf, dass durch die Zugabe von unterschiedlichen C- und Stickstoff (N) quellen unterschiedliche mikrobielle Gruppen aktiv Zellulose abbauen. Wir verwendeten destruktiv beprobte Mikrokosmen, die mit 13C- markierter Zellulose und verschiedenen C- und N-Quellen versetzt wurden, um zellulolytische Aktivitat zu messen und Zellulose abbauende mikrobielle Gruppen zu identifizieren. Wahrend C-Zugaben generell die Atmungsaktivitat (gemessen mittels 12CO2) steigerten, zeigten 13CO2 Messungen und Enzym-Assays, dass N-Zugaben gezielt den Zelluloseabbau forderten. Aktive Zellulose-abbauende mikrobielle Gruppen wurden durch 13C-PLFA-Analyse identifiziert. Die hoheren Abbauaktivitaten in den N-Zugaben waren auch durch erhohte 13C-PLFA Werte sichtbar. Die Zugabe von N fuhrte zu einer Zunahme von Pilz-Markern im Gegensatz zur Zugabe von Glucose, welche zu einer hoheren Abundanz der bakteriellen PLFA-Marker fuhrte. Dies deutet darauf hin, dass der Zelluloseabbau durch diese mikrobiellen Gruppen unterschiedlich limitiert ist. In weiteren saisonalen Untersuchungen fanden wir heraus, dass die 13CO2 Werte im Sommer und Herbst nicht signifikant unterschiedlich waren, dass allerdings Enzymaktivitaten im Herbst niedriger waren als im Sommer. Um mikrobielle Aktivitaten feinauflosend untersuchen zu konnen ist die Analyse auf Einzelzell-Ebene unumganglich. Hoch auflosende Sekundarionen Massenspektroskopie (NanoSIMS) und Raman Mikrospektroskopie sind neue Techniken mit denen es moglich ist einzelne mikrobielle Zellen zu untersuchen. In Kombination mit Stabilen-Isotopen-Tracern ist es moglich Aktivitaten einzelner Zellen zu messen. Aufgrund der Beschaffenheit von terrestrischen Okosystemen wurden diese Techniken jedoch nur sehr begrenzt in diesen Okosystemen eingesetzt, vor allem wegen dem hohen Hintergrund von organischen und anorganischen Bodenpartikeln. In dieser Arbeit konnten wir erfolgreich ein Zellextraktionsprotokoll in Verbindung mit Dichte-Zentrifugation anwenden und den Anteil von Bodenpartikel in unseren Proben stark reduzieren. Dies ermoglichte eine nachfolgende Analyse von Zellen mit NanoSIMS und Raman Mikrospektroskopie. Da nach der Dichte-Zentrifugation die Zellen auf Filtern konzentriert werden, wurden verschiedene Filtermaterialien auf ihre Verwendbarkeit fur Messungen im NanoSIMS 7 untersucht. Salzkristalle konnen Raman- und NanoSIMS-Messungen beeintrachtigen- deswegen testeten wir unterschiedliche Konzentrationen einer Phosphat gebufferten Saline (PBS; 1x PBS bis ddH2O) fur die Aufreinigung von mikrobiellen Zellen. Ziel war es, eine Konzentration zu finden die NanoSIMS Messungen zulasst und die auf der anderen Seite die Zellintegritat aufgrund osmotischer Unterschiede nicht beschadigt. Uberraschenderweise zeigten Zellen die mit Wasser gewaschen wurden die stabilste Morphologie. In einer Machbarkeitsstudie demonstrierten wir, dass es moglich war, Mikroorganismen aus Bodenproben zu extrahieren und mittels NanoSIMS ihre 13C-Cellulose-Abbau- und 15N2-Fixierungsaktivitat nachzuweisen. Die 15N-Anreicherung in diazotrophen Zellen reichte von 2 bis 27 atom% (C-primed) und die 13C-Anreicherung in Zellulose-abbauenden Zellen von 11 – 36 atom% (C- und N-primed). Das angewendete Zellextraktionsprotokoll konnte auch mit Raman Mikrospektroskopie verbunden werden. Es war jedoch nicht moglich, die Aufnahme von 13C in Zellen desselben Mikrokosmus durch den charakteristischen 13C-Phenylalanin-Peak im Zellspektrum nachzuweisen. Weitere Tests ergaben, dass Phenylalanin bevorzugt aus in der Umwelt vorhandenen Aminosauren/Oligopeptide synthetisiert wird, anstatt es aus aufgenommenen C neu herzustellen. Dies erschwert die Anwendung von Raman Mikrospektroskopie zur Detektion von 13C angereicherte Zellen aus Umweltproben mittels des charakteristischen 13C-Phenylalanin-Peaks.