Restricted enzymatic hydrolysis of legumin of broad beans (Vicia faba L.) by trypsin in concentrated solutions. Control of hydrolysis process at the expense of change of enzyme-substrate ratio

Kinetics and mechanism of proteolysis of broad bean (Vicia faba L.) legumin by trypsin in concentrated solutions at different enzyme-substrate ratios (E/S = 1/40, 1/100, 1/200, 1/1000) were studied. By the method of HPLC it was established that during proteolysis process (E/S = 1/40) take place both protein content decrease in hydrolysate and change of its molecular mass (from 360 to 280 kD), which evidences for the mixed type of proteolysis, including cooperative and non-cooperative mechanisms. Decrease of E/S from 1/40 up to 1/100–1/1000 leads not only to unproportional drop in proteolysis rate, but also to decrease of the relative contribution of cooperative proteolysis which is, possibly, connected with presence in protein molecule of at least two groups of attack sites, differentiating by their affinity with enzyme. Change of enzyme-substrate ratio is accompanied also by change of subunit composition of product of non-cooperative proteolysis (‘modified protein’) and also of temperature and enthalpy of its denaturation. Begrenzte enzymatische Hydrolyse von Legumin aus Ackerbohnen (Vicia faba L.) durch Trypsin in konzentrierten Losungen. Kontrolle des Hydrolyseprozesses in Abhangigkeit von der Veranderung des Enzym-Substrat-Verhaltnisses Es wurden die Kinetik und der Mechanismus der Proteolyse des Legumins von Ackerbohnen (Vicia faba L.) durch Trypsin in konzentrierten Losungen bei unterschiedlichen Enzym-Substrat-Verhaltnissen (E/S = 1/40, 1/100, 1/200, 1/1000) untersucht. Mittels HPLC wurde festgestellt, das wahrend des Proteolyseprozesses (E/S = 1/40) der Proteingehalt im Hydrolysat abnahm und eine Veranderung der Molmasse (von 360 auf 280 kD) vonstatten ging; dies ist ein Beweis fur eine gemischte Hydrolyse, die kooperative und nicht-kooperative Mechanismen einschliest. Eine Abnahme von E/S von 1/40 auf 1/100 bis 1/1000 fuhrt nicht nur zu einer unproportionalen Abnahme der Proteolyserate, sondern auch zu einer Abnahme des relativen Beitrages der kooperativen Proteolyse, die moglicherweise in Zusammenhang steht mit wenigstens zwei Angriffsstellen im Proteinmolekul, die in ihrer Affinitat zum Enzym differieren. Eine Veranderung des Enzym-Substrat-Verhaltnisses wird begleitet von einer Veranderung der Zusammensetzung der Subeinheiten des Produktes der nicht-kooperativen Proteolyse (“modifiziertes Protein”) und auch der Temperatur und Enthalpie dessen Denaturierung.