Diferenciación epitelial in vitro de células mesenquimales troncales humanas (hCMTs) de tejido adiposo (TA) y médula ósea (MO): caracterización celular y estudio de expresión de HLA I y II

espanolIntroduccion: Las celulas troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo o medula osea constituyen uno de los tratamientos de terapia celular mas utilizados en los ensayos clinicos actuales por su capacidad inmunomoduladora. Ademas, por su potencial de diferenciacion a celulas epiteliales pueden ser utilizadas en ingenieria tisular incorporadas a tejidos artificiales como la piel o cornea, sustituyendo a las celulas epiteliales autologas de estos tejidos. Es necesario realizar una correcta caracterizacion de estas celulas diferenciadas y estudiar el efecto de la diferenciacion en la expresion del HLA de clase I y II. Objetivos: Caracterizar y realizar los controles de calidad GMP en dos lineas de celulas mesenquimales troncales humanas de distintos origenes (tejido adiposo y medula osea) tras diferenciarlas a celulas epiteliales in vitro, y analizar si se modifica la expresion de los marcadores HLA I y II antes y despues del proceso diferenciador. Metodologia: Se ha realizado el aislamiento y expansion de las dos lineas celulares de celulas mesenquimales troncales a partir del tejido fuente y se ha procedido a su diferenciacion in vitro a celulas epiteliales mediante medios de cultivos suplementados con factores de crecimiento especifico. Se han realizado controles de calidad siguiendo los requerimientos de las normas de correcta fabricacion y se ha estudiado por citometria de flujo la expresion de HLA tipo I y II antes y despues del proceso diferenciador. Finalmente se ha comprobado mediante estudio histologico e inmunohistoquimico las caracteristicas de las celulas diferenciadas. Resultados: Se han aislado dos lineas de celulas mesenquimales troncales de tejido adiposo y medula osea que cumplen los controles de calidad propuestos. Tras el proceso diferenciador in vitro, las celulas mesenquimales troncales humanas no expresan marcadores HLA (I y II) importantes en la respuesta inmune, pero si expresan debilmente proteinas relacionadas con los principales estratos epiteliales (CK5, CK6 y CK14). Conclusion: La ausencia de expresion de marcadores de HLA I y II por citometria de flujo en las celulas diferenciadas favoreceria su uso con caracter alogenico en la construccion de piel y corneas humanas por ingenieria de tejidos, sin embargo, son necesarios mas estudios que confirmen estos resultados preliminares y protocolos que optimicen el proceso diferenciador in vitro de las celulas mesenquimales troncales. EnglishBackground: Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow are one of the most common cell therapy procedures used in recent clinical trials due to their immunomodulation capacity. Furthermore, for their epithelial differentiation potential can be used in tissue engineering, incorporated in artificial tissues such as skin and cornea, replacing autologous epithelial cells. It is necessary to make a correct cellular characterization of differentiated cells and to study the effect in HLA I and II expression. Objetives: Characterization and quality controls under GMP conditions of in vitro differentiated human mesenchymal stem cells from different sources (adipose tissue and bone marrow) to epithelial lineage, and study of HLA I and II expression before and after differentiation. Methods: Isolation and expansion of two human mesenchymal stem cells lines from their tissues of origin and in vitro differentiation to epithelial cells using culture mediums supplemented with specific growth factors. Quality controls according Good Manufacturing Practices have been made and HLA I and II expression before and after differentiation have been studied. Finally, characteristics of differentiated cells have been demonstrated by histological and immunohistochemical analysis. Results: Two human mesenchymal stem cells lines from adipose tissue and bone marrow have been isolated complying with the proposed quality controls. After in vitro differentiation, human mesenchymal stem cells do not express HLA (I and II) markers, which are important in immune response, but weakly express proteins related to main epithelial layers of human skin (CK5, CK6 and CK14). Conclusion: The absence of expression of HLA I and II by flow cytometry in differentiated cells would promote the use of them with allogenic character to construct human skin and cornea by tissue engineering, however, more studies and protocols are required to confirm these preliminary results and to optimize in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells.