Avances en las propiedades de biocatalizadores: diseño y obtención de materiales mesoporosos ordenados como soportes para la inmovilización no covalente de enzimas

En este trabajo se aborda de forma multidisciplinar la obtencion de biocatalizadores mediante el diseno y sintesis de materiales mesoporosos ordenados como soportes a medida para la inmovilizacion de enzimas con distintas caracteristicas. Se han obtenido novedosos materiales siliceos e hibridos organosiliceos de tipo MMO (Materiales Mesoporosos Ordenados) disenados a partir de las caracteristicas de dos enzimas con distintas actividades y propiedades: Lacasa de Myceliophthora thermophila, una oxidorreductasa multicobre que cataliza la oxidacion de diferentes compuestos fenolicos, aminas y ligninas, tiene un peso molecular de 110 KDa y un punto isoelectrico de 4,2, y lipasa de Candida antarctica B encargada de la hidrolisis de trigliceridos a acidos grasos libres y glicerol, su peso molecular es 32 KDa y su superficie presenta un dominio hidrofobico. En la presente tesis doctoral se han sintetizado materiales siliceos mesoporosos ordenados avanzados, con poros de tipo canal, para la inmovilizacion post-sintesis y estabilizacion de lacasa. Estos materiales poseen una elevada superficie especifica y estrecha distribucion de tamano de poro, que resultan de un sistema ordenado de mesoporos de simetria definida. Los materiales puramente siliceos se utilizaron como soportes para estudiar las caracteristicas morfologicas de las particulas y los canales de los poros mas adecuadas para inmovilizar lacasa. La funcionalizacion con grupos organicos para aumentar la afinidad quimica hace necesaria la obtencion de poros de mayor diametro para permitir una buena difusion del enzima que permita alcanzar altos valores de carga enzimatica. El tamano de poro se ha adaptado a las dimensiones moleculares de la enzima lacasa adecuando las condiciones de sintesis y mediante la adicion de moleculas organicas que actuan de expansores de las micelas de surfactante que actuan de plantilla de la estructura porosa. Para la inmovilizacion de lacasa, la superficie de estos materiales se ha modificado incorporando cadenas organicas que contienen grupos funcionales de tipo amino, capaces de interaccionar electrostaticamente con la enzima en unas condiciones de pH adecuadas. Esta funcionalizacion organica se ha realizado tanto por anclaje (posterior a la sintesis de la estructura de silice) como por cocondensacion (incorporacion directa durante la sintesis). Ademas, se han sintetizado novedosas organosilices periodicas mesoporosas que incorporan dentro de la propia pared del soporte tanto el grupo etileno para la inmovilizacion de lipasa, como grupos amino para la inmovilizacion de lacasa, y con un diametro de poro suficientemente grande para inmovilizar a las enzimas. Se han obtenido biocatalizadores con altas cargas enzimaticas y elevada actividad catalitica en los que los tamanos de poro estan ajustados a las dimensiones de la enzima (confinamiento), y en los que la afinidad quimica enzima-soporte es alta (interacciones hidrofobicas con lipasa y electrostaticas con lacasa). La conjuncion de estas dos propiedades contribuye a la retencion practicamente irreversible de las enzimas en el interior de los entramados porosos de los soportes, dificultando o incluso eliminando el lixiviado de las enzimas, a pesar de la naturaleza no covalente de la union al soporte. La inmovilizacion mejora la estabilidad de las enzimas lacasa y lipasa en presencia de etanol y metanol, respectivamente. Tambien, se ha desarrollado una estrategia para inmovilizar la enzima en el interior del material mesoporoso durante la propia etapa de sintesis (inmovilizacion in-situ). Esto permite encapsular la enzima lacasa en sistemas con poros de tipo caja-ventana, en los que las cajas de grandes dimensiones que contienen la enzima, estan comunicadas entre si por ventanas estrechas, de menor diametro que las dimensiones de la enzima. La enzima queda retenida en el interior de las cajas, evitando cambios estructurales de las enzimas y protegiendola del medio externo. Para la encapsulacion in-situ de la enzima dentro de los materiales siliceos mesoporosos se ha requerido un profundo estudio del uso de diferentes surfactantes, aditivos y condiciones de sintesis para obtener la encapsulacion de lacasa sin que el medio de sintesis produzca la desactivacion de la misma. La adecuada seleccion de los surfactantes y aditivos ha sido un factor clave para obtener micelas diferentes alrededor de las moleculas de enzimas que actuan como plantillas del sistema, y que permiten obtener materiales siliceos mesoporosos que contienen moleculas de enzima en su interior. Finalmente, por primera vez se ha conseguido mediante estudios avanzados de microscopia electronica de transmision (STEM-HAADF-EELS con aberracion corregida) localizar directamente a las enzimas en el interior de los poros y cavidades de los soportes.