CB. Proposta para padronização de meios de cultura para indução da formação de biofilme e quantificação de sua massa e da matriz extracelular em diferentes cepas bacterianas

Introducao: Varios trabalhos tem surgido a respeito da aderencia bacteriana e consequente formacao de biofilme e a dificuldades em sua inibicao de formacao e remocao a partir de bacterias responsaveis pela maioria dos processos infecciosos, porem ha poucos registros de pesquisas feitas de carater metodologico levando o meio de cultura como variavel. Acreditamos que a resposta da bacteria quanto ao meio de cultura para a formacao do biofilme e de significativa importância, visto que a formacao deste e influenciada diretamente pelos substratos presentes e suas quantidades podendo prejudicar a analise que se queira realizar superestimando ou nao os resultados obtidos. Objetivo: Comparar os meios de cultura em caldo que estimulam o crescimento bacteriano, e observar qual destes seria o mais adequado para induzir de maneira eficiente e suficiente a formacao do biofilme bacteriano e expressao do polissacarideo extracelular. Metodologia: A producao e formacao do biofilme foi realizada em microplacas de poliestireno de 96 pocos. Para este experimento foram utilizados 3 cepas padrao ATCC (cepa ATCC 14028 de Salmonella sp, ATCC 25923 de S. aureus e ATCC 25922 de E. coli), estes foram suspensos em solucao tampao na escala 0,5 de Mac Farland e inoculados em 4 tipos de meios de cultivo (Brain Heart InfusionBroth-BHI, Caldo Nutriente, Caldo Mueller Hinton e TripticSoyBroth-TSB) na proporcao 1:1, incubados a 37°C em estufa bacteriologica por 24 horas, todo processo foi realizado em 2 conjuntos, um para avaliar a formacao do biofilme e outro para a producao de polissacarideo em triplicata. Apos este periodo, cada meio de cultura foi retirado cuidadosamente dos pocos e lavados em solucao tampao. As placas foram levadas a secagem em estufa bacteriologica por 1 hora. Para realizacao da quantificacao dos biofilmes foi adicionado 100 µL em cada poco de solucao de cristal violeta a 0,5% por 5 minutos, a solucao foi retirada lavando-se cuidadosamente a placa e posta para secagem. Para a quantificacao da matriz extracelular, foi adicionado 100 µL em cada poco de solucao de Safranina a 1% por 5 minutos, a solucao foi retirada lavando-se cuidadosamente a placa e posta para secagem. Ao final, foram adicionados nos pocos100 µL de etanol 95% e levados para leitura da densidade optica em espectrofotometro, no comprimento de onda de 570 nm as placas coradas com o cristal violeta e 492 nm para a Safranina. Resultados: Comparando a expressao do crescimento bacteriano frente ao meio padrao, Mueller Hinton, com os outros meios testados identificamos uma pequena variacao entre a formacao do biofilme e da producao do polissacarideo. Para a formacao do biofilme a cepa de S. aureus apresentou uma variacao de 14,29%; E. coli 8,7% e Salmonella sp 18,89%. Ja para a producao de polissacarideo a cepa de S. aureus apresentou uma variacao de 12,1%; E. coli 18,31% e Salmonella sp 11,01%. Sendo assim, verificamos que nao houve diferencas expressivas entre os meios de cultivo nos estimulos da formacao do biofilme e producao do polissacarideo. Conclusao: Concluimos que todos os meios de cultura testados fornecem substratos basicos para o desenvolvimento do biofilme e para a producao do polissacarideo extracelular nao estimulando ao excesso ou inibindo sua producao.