Développement méthodologique en couplage nanoLC-spectrométrie de masse pour l'analyse de protéines entières : application à la détection, d'un biomarqueur du cancer du sein : le nerve growth factor

La recherche de biomarqueur dans les fluides physiologiques est actuellement un axe de recherche en plein essor. L'identification de ces proteines est cruciale pour detecter plus precocement les maladies. Actuellement l'identification de proteine est effectuee a partir de la detection de leurs peptides obtenus apres digestion enzymatique. Il est cependant difficile de detecter par cette methode tant les modifications post-traductionnelles que les proteines de petite masse moleculaire presentes a faible concentration dans un melange biologique complexe. Le developpement de nouvelles methodes sensibles permettant d'analyser ces proteines intactes est donc necessaire. L'objectif de ce travail a donc ete de developper une nouvelle methode de detection de proteines entieres basee sur un couplage nano-chromatographie liquide / spectrometrie de masse. L'utilisation d'une nanocolonne C4 montee sur la nanoLC couplee a un spectrometre de masse a trappe ionique permet de separer et de detecter en ligne les proteines entieres. L'acquisition en mode SIM (Selected Ion Monitoring) offre une meilleure sensibilite et specificite de detection en selectionnant trois ions multicharges caracteristiques de la proteine. La methode developpee a ensuite ete appliquee pour detecter le NGF (Nerve Growth Factor), proteine neurotrophique de 13,5 kDa, qui est un marqueur potentiel du cancer du sein. Une limite de detection de 0,1 ng/mL a ete atteinte pour detecter le NGF recombinant humain. Cette methode a permis de detecter et doser le NGF dans la lignee cellulaire cancereuse mammaire MCF-7, ce resultat a ete confirme par une analyse a haute resolution (FTICR-MS). L'etude de serums a mis en evidence l'importance d'eliminer avant l'analyse les proteines de forte abondance. La depletion des proteines majoritaires par immunoaffinite a permis d'analyser les echantillons de serums de souris ou de patientes atteintes d'un cancer du sein, pour y detecter le NGF. Ces resultats montrent la possibilite d'utiliser le couplage nanoLC - spectrometrie de masse en proteine entiere pour detecter un nouveau marqueur potentiel du cancer du sein. Cette methode pourra etre egalement appliquee a d'autres pathologies.