β_1-和β_2-微管蛋白基因在赤霉病菌抗多菌灵中的作用

【目的】揭示β1-微管蛋白基因（β1-tub）和β2-微管蛋白基因（β2-tub）在赤霉病菌（Gibberella zeae）对多菌灵的抗性过程中所起的作用。【方法】采用PCR克隆测序法测定Js449（EC50=7.911μg·m L-1）、Js462（EC50=6.515μg·m L-1）、Js484（EC50=5.031μg·m L-1）、Js506（EC50=8.455μg·m L-1）和Js519（EC50=6.280μg·m L-1）等5个多菌灵抗性菌株的α-、β1-、β2-、γ-tub序列,并与敏感菌株HG-1（EC50=0.552μg·m L-1）进行比对。采用实时荧光定量PCR（q PCR）测定β1-tub和β2-tub在多菌灵胁迫下的抗性菌株Js506中的相对表达量。构建β1-tub和β2-tub的超量表达载体,分别在HG-1中表达。运用split PCR获得含有潮霉素磷酸转移酶基因和目标基因的融合片段,并对Js506进行原生质体转化,通过同源重组获得β2-tub的敲除体和互补体。对菌株Js506、HG-1及其突变体分别进行多菌灵敏感性测定、菌落生长观察和致病力测定。【结果】基因比对结果表明,5个抗性菌株的α-、β1-、γ-tub基因序列与敏感菌株的一致。对β2-tub序列比对结果表明,Js449、Js462和Js506菌株的第167位氨基酸由苯丙氨酸（Phe）变为酪氨酸（Tyr）。Js484菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸（Phe）变为酪氨酸（Tyr）。Js519菌株的第198位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为谷氨酰胺（Gln）。5μg·m L-1多菌灵能诱导Js506菌株的β1-tub表达量显著上调（P〈0.05）。10μg·m L-1的多菌灵对Js506菌株的β2-tub表达量影响不显著。β1-tub的超量表达使HG-1突变体的EC50增加至2.839μg·m L-1,抗药性显著增强（P〈0.05）。β2-tub超量表达突变体的抗性水平与野生型菌株无显著差异。对Js506菌株的β2-tub进行敲除试验,分别获得了2个转化体（△β2tub-Js506-1、△β2tubJs506-2）,经潮霉素抗性筛选、PCR和Southern杂交验证,确认2个转化体均不含有β2-tub。与野生型菌株Js506相比,敲除体△β2tub-Js506-1（EC50=0.078μg