Etude des mécanismes de résistance aux inhibiteurs de FLT3 dans les leucémies aigues myéloïdes

Les leucemies aigues myeloides (LAM) constituent un groupe heterogene d’hemopathies malignes resultant de la proliferation clonale d’un progeniteur myeloide bloque dans sa differenciation. De pronostic globalement defavorable, depend de l’âge et de facteurs cytogenetiques et moleculaires. La mutation du gene FLT3 de type duplication en tandem du domaine juxta-membranaire (ITD : internal tandem duplication) est detectee dans 30% des echantillons de LAM, correle a une frequence accrue de rechutes et a un pronostic defavorable. La mutation ITD conduit a une activation deregulee et constitutive de recepteur FLT3, induisant une addiction oncogenique des cellules leucemiques aux voies de signalisation en aval, designant FLT3 comme cible therapeutique pertinente dans les LAM. Ainsi, de nombreux inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant FLT3 ont ete developpes, certains ayant une efficacite significative en monotherapie et ameliorant la survie des patients ayant une mutation FLT3-ITD en association aux traitements conventionnels. Neanmoins, la plupart des patients traites en monotherapie, et une proportion importante de ceux traites en association rechutent en raison de mecanismes de resistance developpes par la cellule pour echapper a l’action des ITK. L’etude de ces mecanismes est un enjeu essentiel afin d’ameliorer l’efficacite des traitements dans les LAM FLT3-ITD. C’est cette thematique que j’ai souhaite aborder au cours de ma these. Nous avons tout d’abord, mis en evidence par des approches transcriptomiques et proteomiques une nouvelle cible de PIM2, la serine threonine kinase RSK2, ayant un role dans le controle de l’apoptose des cellules de LAM. Mes collegues et moi-meme avons montre que RSK2 etait fortement diminuee suite a l’invalidation de PIM2 par interference ARN dans une lignee de LAM FLT3-ITD (MOLM-14), tant au niveau ARNm que proteique. Par une technique de sensibilisation a l’apoptose a l’aide de peptides BH3 ainsi que par un inhibiteur de Bcl-2, le compose ABT-199, nous avons montre le role de RSK2 dans le controle de l’apoptose mitochondriale en contexte FLT3-ITD. Nous avons ensuite observe que la surexpression de RSK2 compensait la mort cellulaire induite par l’invalidation de PIM2, renforcant ainsi le role de cette nouvelle voie dans le controle de la survie cellulaire. Finalement, nous avons suggere dans des modeles murins de la maladie que RSK2 pourrait participer a la resistance aux ITK ciblant FLT3. Afin de poser la question de ces mecanismes de resistance sans a priori, j’ai adapte a notre modele de LAM une banque CRISPR pan-genomique dans le but de la cribler avec differents ITK et mettre a jour de nouveaux mecanismes de resistance aux ITK. J’ai utilise l’enzyme dCas9 permettant non pas des cassures de l’ADN mais une modulation de la transcription de genes cibles, soit une repression lors de la fusion au corepresseur KRAB (CRISPRi), soit une activation lors de la fusion a VP64 (CRISPRa). La dCas9 et les banques ont ete transduites par des lentivirus dans 2 lignees FLT3-ITD (MOLM-14 et MV4-11). Ces cellules ont ete amplifiees en culture liquide ou sur des cellules stromales mesenchymateuses (MSC) et traitees soit par du DMSO soit par l’un des 3 ITK ciblant FLT3 suivants : quizartinib, midostaurine ou ponatinib. L’identification et la quantification des ARN guides par sequencage haut debit et l’analyse bioinformatique nous renseigne enfin sur les genes dont la repression favorise l’effet des ITK, pouvant ainsi representer de nouveaux mecanismes de resistance intrinseques (culture liquide) et/ou extrinseques (co-culture MSCs) a la cellule. Le troisieme axe de mon travail a porte sur la caracterisation des modifications du profil de signalisation global induites par les mutations du domaine tyrosine kinase (TKD) de FLT3-ITD impliquees dans la resistance aux ITK.