Desenvolvimento de teste de detecção molecular de genótipos vacinais e de campo do vírus da bronquite infecciosa (VBI) das galinhas

A producao industrial de aves e um processo intensivo e muitas doencas infecciosas afetam os lotes nas granjas comerciais. A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) e uma destas doencas, afetando aves de todas as idades e causando importantes perdas economicas. A BIG e causada pelo virus da bronquite infecciosa (VBI) que pertence a familia Coronaviridae e tem como caracteristica marcante as espiculas (spike, S) no envelope. O material genetico e RNA fita simples, sentido positivo, com aproximadamente 27.600 nucleotideos. O VBI apresenta grande diversidade genetica, sendo classificado em sorotipos e genotipos vacinais (como a cepa Massachusetts - Mass) ou variantes. Estudos recentes demonstram que existe uma grande disseminacao de genotipos variantes de campo no Brasil (denominados BR e classificados em BR-I e BR-II). A confirmacao de infeccao pelo VBI e realizada por testes laboratoriais como isolamento e deteccao do RNA viral. Tecnicas moleculares modernas, como a transcricao reversa seguida da reacao em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR), possibilitam um diagnostico sensivel, rapido e menos laborioso. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver tecnicas laboratoriais de RT-qPCR para a deteccao especifica da cepa Mass e genotipos BR. Foram obtidas 21 amostras de virus isolados (3 vacinas comerciais e 4 isolados de liquido alantoide do genotipo Mass, e 14 isolados de liquido alantoide dos genotipos BR-I e BR-II) e varias amostras clinicas de aves (matrizes, poedeiras e frangos de corte) em pools de orgaos. Em paralelo, foram desenhados conjuntos de primers e sondas especificos para os genotipos Mass e BR, tendo como alvo o gene S (porcao S1). As amostras foram submetidas a extracao do RNA viral e analisadas com o teste de deteccao padrao de VBI (RT-qPCR da regiao 5´UTR do genoma) e com os dois metodos genotipos especificos (Mass RT-qPCR e BR RT-qPCR). As amplificacoes foram consideradas positivas nas amostras com leitura ate o ciclo (Ct) 35. Os amplicons foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida para observacao dos fragmentos de tamanho esperado: 143 pares de bases (bp) para o 5´UTR RT-qPCR, 120bp para o Mass RT-qPCR e 219 bp para o BR RT-qPCR. Os resultados obtidos demonstraram a deteccao de todas as amostras de genotipo Mass (3 vacinas e 4 isolados) e a nao amplificacao de nenhuma amostra dos genotipos BR utilizando o metodo Mass RT-qPCR, inclusive com uma elevada correlacao de valores de Ct com o teste padrao. No entanto, apenas as amostras de genotipos BR-I apresentaram resultados positivos com o metodo BR RT-qPCR (Mass e BR-II apresentaram resultados negativos) e nao houve uma boa correlacao com os valores de Ct do teste padrao. Estes resultados preliminares demonstram o desenvolvimento de um metodo para a deteccao de amostras do genotipo Mass, mas ainda nao dos genotipos BR. Novos estudos estao sendo desenvolvidos para a implementacao do metodo especifico para deteccao de amostras do genotipo BR.