Papel de la N-glicosilación de proteinas en la virulencia de Fusarium oxysporum

1. Introduccion o motivacion de la tesis El objetivo general ha sido investigar la N-glicosilacion terminal de proteinas en la especie patogena de tomate Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, centrandose en el estudio de una N-acetilglucosamina transferasa (Gnt2) localizada en el aparato de Golgi, y analizando su efecto en la estructura y composicion de la pared celular, y el patron de proteinas de secrecion y capacidad de virulencia. La glicosilacion es la adicion de oligosacaridos a proteinas y lipidos para formar glicoconjugados tras la accion secuencial de enzimas especificas (Alberts et al, 1983). Las etapas conservadas del proceso de N-glicosilacion tienen lugar en el reticulo endoplasmico, resultando en la sintesis de un oligosacarido comun que se transfiere en bloque a residuos de asparragina en las proteinas diana, y van seguidas de la adicion y/o eliminacion de residuos de glucosa. Las etapas posteriores localizadas en el aparato de Golgi generan una gran variabilidad de glicanos cuya funcion precisa es aun desconocida (Leal et al, 2010; Munro, 2001). La modificacion o deficiencia de estas estructuras puede causar desordenes y patologias graves (Sparks & Krasnewich, 1993) por alteracion de la funcion y la pauta de secrecion de estas glicoproteinas. 2. Contenido de la investigacion El analisis in silico del genoma de F. oxysporum ha permitido identificar una compleja familia genica de N-acetilglucosamina transferasas ortologas a Gnt1 de S. cerevisiae (Yoko-o et al, 2003). Se procedido a estudiar la funcion y localizacion de Gnt2, destacando su duplicacion genica en el genoma del hongo. La localizacion subcelular de la proteina Gnt2 se ha llevado a cabo mediante fusion traduccional de la fase codificante de este gen con la correspondiente de la proteina verde fluorescente (GFP), seguido del analisis bioquimico y microscopico de las estirpe silvestre y los mutantes obtenidos. confirmando su presencia en el aparato de Golgi (Chege & Pfeffer, 1990). Para analizar el papel de Gnt2 se han delecionado de manera dirigida ambas copias del gen y se ha caracterizado a nivel estructural, fisiologico y funcional el fenotipo del mutante nulo obtenido. La ausencia de la proteina Gnt2 resulta en menor produccion de algunas enzimas liticas extracelulares y del contenido de N-glicanos totales unidos a proteinas de pared. Menor crecimiento en presencia de compuestos toxicos que interaccionan con la pared celular o la membrana, y mayor sensibilidad a estres termico. A nivel intracelular tambien se observan cambios en la abundancia de proteinas relacionadas con estres, choque termico, trafico intracelular y sintesis de aminoacidos. A nivel patotipico el mutante muestra virulencia reducida en ambos sistemas modelo, animal y vegetal. Los analisis de microscopia electronica de transmision no indican diferencias apreciables en la composicion quimica principal de la pared, constituida por s-glucano-quitina, pero si alteraciones que implican cambios en la morfologia celular, originando septos torcidos y mayor adhesion entre las hifas. 3. Conclusiones La proteina deducida Gnt2 pertenece a una compleja familia genica de N-acetilglucosamina transferasas (Gnts) con seis representantes (gnts) paralogos entre si y ortologos a GNT1 de Saccharomyces cerevisiae. Se localiza en las cisternas del aparato de Golgi y participa en la maduracion y elongacion de los N-glicanos de algunas proteinas de pared, asi como de otras intra- o extracelulares. Su ausencia afecta directamente a la pared redundando en una disminucion de la masa total y menor grado de polimerizacion de los glicanos unidos a dichas proteinas diana, y alterando las propiedades fisico-quimicas y su composicion glicoproteica en los mutantes. Estos cambios sufridos en el mutante resultan en mayor sensibilidad a compuestos toxicos que reaccionan con pared y membrana celular, asi como en patrones aberrantes de agregacion de hifas atribuido al menor contenido de galactofuranosas constituyentes de los N-glicanos de proteinas de superficie , y defectos en septacion. La ausencia de Gnt2 altera el perfil proteico de los mutantes causando la desaparicion de algunas enzimas de degradacion de pared vegetal, de proteinas de detoxificacion de compuestos oxidantes y tomatina, de metabolismo de aminoacidos, de matriz extracelular, de remodelacion y de biogenesis de pared; estando menos representadas algunas de rutas de secrecion, o por el contrario, aumentando otras de respuesta a estres o del metabolismo del nitrogeno. Estos defectos de N-glicosilacion del mutante resultan en mayor sensibilidad al estres termico, menor produccion de puentes de anastomosis hifal (CATs) y retraso en la colonizacion del hospedador y en el desarrollo de la enfermedad de F. oxysporum f.sp. lycopersici en plantas de tomate Lycopersicum esculentum, y en larva de la polilla de la cera Galleria mellonella. 4. Bibliografia - Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (1983) Molecular Biology of the Cell, New York: Garland Science. - Chege NW, Pfeffer SR (1990) Compartmentation of the Golgi Complex: Brefeldin A Distinguishes trans Golgi Cisternae from trans Golgi Network. J Cell Biol 111: 893-899. - Leal JA, Prieto A, Bernabe M, Hawksworth DL (2010) An assessment of fungal wall heteromannans as a phylogenetically informative character in ascomycetes. FEMS Microbiol Rev 34: 986-1014. - Munro S (2001) What can yeast tell us about N-linked glycosylation in the Golgi apparatus? FEBS Lett 498: 223-227. - Sparks SE, Krasnewich DM (1993) Congenital Disorders of Glycosylation Overview. In Gene Reviews, Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, Stephens K, Adam MP (eds). Seattle (WA). - Yoko-o T, Wiggins CA, Stolz J, Peak-Chew SY, Munro S (2003) An N-acetylglucosaminyltransferase of the Golgi apparatus of the yeast Saccharomyces cerevisiae that can modify N-linked glycans. Glycobiology 13: 581-589.