Nouvelles approches pour la caractérisation des mutations de résistance aux antifongiques

Les mecanismes de resistance aux antifongiques azoles et aux echinocandines reposent en grande partie sur des mutations des genes codant la cible. Chez les levures du genre Candida , il s’agit du gene codant la proteine Erg11, la lanosterol demethylase de la voie de biosynthese de l’ergosterol, qui est la cible des azoles, et du gene codant la proteine Fks1, la 1,3-s-D-glucan synthase, cible des echinocandines. Le sequencage nucleotidique des genes ERG11  et FKS1  a permis de mettre en evidence de nombreux polymorphismes nucleotidiques (SNP) chez des isolats resistants. Neanmoins, le role des SNP dans la resistance aux antifongiques n’a ete demontre que pour tres peu d’entre eux, soit par la mesure de l’activite enzymatique en presence ou en absence de l’inhibiteur, ou bien par l’expression heterologue d’un allele mute dans une espece modele de levure, generalement Saccharomyces cerevisiae . Or, cette espece est peu sensible aux antifongiques azoles, et elle n’appartient pas au clade CTG des Candida (qui decodent preferentiellement le codon CTG en serine au lieu d’une leucine), ce qui necessite le cas echeant de corriger les codons des alleles ERG11 ou FKS1 de Candida avant qu’il ne soient exprimes chez S. cerevisiae . Dans cette etude, nous decrivons une methode d’ingenierie genetique originale pour effectuer du remplacement d’allele chez une espece de Candida sensible a tous les antifongiques utilises par voie systemique, Candida lusitaniae . C’est une espece haploide qui appartient au clade CTG des Candida , dont le genome est sequence et pour laquelle nous disposons de tous les outils moleculaires pour modifier le genome. Pour cibler l’integration de l’allele mute par recombinaison homologue en lieu et place de l’allele sensible normalement exprime par la levure, nous avons developpe une strategie qui consiste a implanter a proximite des alleles a remplacer des demi-marqueurs d’auxotrophie non-fonctionnels. La partie manquante du marqueur d’auxotrophie est amenee avec l’allele ERG11 ou FKS1 portant la mutation a analyser, ce qui permet de selectionner les levures ayant effectue le remplacement d’allele sur des milieux synthetiques simples. Cette technique permet l’expression heterologue des alleles ERG11 de differentes especes de levure chez C. lusitaniae , notamment de C. albicans sans avoir d’effet de trailing ou de double ellipse lors de la determination des CMI. Elle permet en outre d’etudier l’effet de plusieurs SNPs combines au sein d’un meme allele. Dans le cas du gene FKS1 , et a cause de sa grande taille (environ 6 kbp), le remplacement complet de l’allele est effectue en deux parties grâce a ce qui s’apparente a un pontage moleculaire. Cette strategie a ete validee par l’expression chez C. lusitaniae des mutations de resistance les plus courantes et permettra d’etudier plus facilement le role de SNPs en dehors des regions Hot Spot.