Comparaison des extractions MEPS et SPE pour la quantification par LC-MS/MS d'androgènes et d'oestrogènes sous forme libres et conjugués dans du sérum de rat.

La reglementation REACH a pour objectif d'ameliorer le niveau de protection de la sante et de l'environnement. Ainsi, depuis le 1er juin 2007, les substances sont classees selon leurs proprietes physico-chimiques, toxicologiques et environnementales. Leur pouvoir de bioaccumulation, leur persistance dans l'environnement, ou encore leur toxicite pour la reproduction sont alors etudies. Dans ce sens, certaines substances sont qualifiees de perturbateurs endocriniens. Ce terme designe en fait des substances qui interferent avec les fonctions du systeme hormonal. Selon REACH, ces substances sont considerees comme des substances extremement preoccupantes du fait de leur toxicite pour la reproduction. Ainsi, certains composes tels que le bisphenol A, l'atrazine, la vinclozoline ou encore l'HPTE sont suspectes d'etre des perturbateurs endocriniens. Afin d'etudier directement ces derniers, des etudes sont menees pour etablir une relation de causalite entre l'exposition aux perturbateurs endocriniens et certaines maladies. Dans ce contexte, en collaboration avec l'INERIS (Institut National de l'Environnement industriel et des RISques), l'impact de ces perturbateurs endocriniens (bisphenol A, atrazine, vinclozoline, HPTE) sur le systeme hormonal est etudie par la mesure in vivo de la balance androgenes / oestrogenes. Pour cela, les fractions libres et les fractions conjuguees des hormones sexuelles dans le serum sont detectees et quantifiees par LC-MS/MS. Les molecules recherchees sont alors la testosterone (T) et l'androstenedione (A) pour les androgenes, l'oestrone (E1) et la 17-s-oestradiol (E2) pour les oestrogenes ainsi que les metabolites sulfo- et glucuro-conjugues de ces derniers. De plus, les pesticides auxquels sont exposes les especes d'etudes (rats adultes mâles et femelles) sont aussi doses pour etablir la relation de causalite supposee. Deux techniques d'extraction ont alors ete developpees : la premiere innovante permet de minimiser les quantites de matrice et solvants, il s'agit des MEPS (C18) (Micro- Extraction sur Phase Solide) et la seconde plus classique, la SPE (Oasis HLB). Le choix de la methode d'extraction repose sur divers criteres, a savoir, les rendements, la linearite, la LOD-LOQ et l'effet matrice. Les deux techniques permettent de travailler sur une large gamme de linearite (de 1 a 2000 ppb) et presentent des LOD allant de 0,2 a 1 ppb et des LOQ de 1 ppb a 20 ppb. Des rendements de 60% a 84% ont ete obtenus sur SPE pour tous les composes, les resultats sont similaires avec les MEPS a l'exception des metabolites conjugues (13 a 40 %). Afin de pouvoir etudier selectivement ces metabolites glucuronides et sulfates, de nouvelles phases MEPS devront etre developpees. Les effets de matrice constates sont corriges par etalonnage interne. Cette comparaison permet donc de choisir la methode d'extraction optimale par SPE, fiable et repetable, qui sera appliquee aux 400 echantillons de serum de rats adultes.