Применение системы анализа изображения для характеристики лигандов ионотропных глутаматных рецепторов в культуре нейронов

Предложен способ качественного и количественного анализа эффектов соединений, взаимодействующих с глутаматными NMDA-, AMPA-, и KA-рецепторами, с использованием неинвазивного метода микрофотометрии. Метод основан на регистрации активности лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов с применением двухволнового флуоресцентного зонда Fura-2. Подобраны условия, при которых повторное кратковременное (до 30 с) воздействие агонистов NMDA-, АМРА- и КА-рецепторов вызывает в большинстве клеток кальциевый ответ, практически идентичный первому, что дает возможность использовать реакцию клетки на первую аппликацию лиганда в качестве контроля. Последнее позволяет получать статистически репрезентативные кривые доза–ответ, усредненные по большой популяции клеток. С целью повышения чувствительности метода для каждого лиганда определен возраст культуры, оптимальный для проведения эксперимента. С целью сравнения результатов различных экспериментов и получения более точных значений констант активации и ингибирования введены определенные правила нормирования сигналов. Показано, что вариабельность кальциевых ответов однотипных индивидуальных нейронов на агонисты глутаматных рецепторов во многом обусловлена степенью и кинетикой их десенситизации. Для характеристики лигандов АМРА- и КА-рецепторов опыты проводили в присутствии ингибиторов десенситизации – циклотиазида и конканавалина A, соответственно, которые увеличивали амплитуду ответов и превращали импульсные ответы на агонисты в ступенчатые. Разработанный метод позволяет обнаружить в составе неизвестного образца лиганды исследуемых рецепторов, определить дозы полуактивации и полуингибирования, а также тип ингибирования. Метод сочетает высокую чувствительность, специфичность и производительность, обусловленную возможностью одновременного неинвазивного анализа индивидуальной активности сотен клеток. Методика применима как для получения характеристик, усредненных по всем исследуемым нейронам, так и для выбранных субпопуляций клеток и одиночных нейронов.