Charakterisierung der dynamischen Interaktion des Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptors mit den Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6)-Kanälen und Generierung von β-Zell-spezifischen GC-A-knock-out-Mäusen sowie die Analyse der Bedeutung von ANP für die Insulin-Homöostase unter pathophysiologischen Bedingungen

Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellularen Produktion von cGMP uber den membranstandigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert auserdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkanalen Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst kurzlich konnte gezeigt werden, dass ANP uber GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabhangige Weise stimuliert. Um eine mogliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunprazipitation mit einem anti-Flag-Antikorper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabhangig von ANP mit GC-A ko-immunprazipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Domane fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer Uberproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antikorper die Koimmunprazipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schlieslich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgefuhrt, um die lokale Nahe von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine mogliche ANP-induzierte Konformationsanderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen fuhrte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabhangig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP fuhrte dagegen zu keiner Veranderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse bestatigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der fur den neuen cGMP-unabhangigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A fur die Insulinausschuttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans’schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP fur die systemische Glukose-Homoostase zu ergrunden, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans’schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht moglich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressionsanderung von GC-A in anderen Geweben fuhrte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO Mause blieb unauffallig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP fur die Insulinausschuttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere fur 12 Wochen einer fettreichen Ernahrung (60% Fett) ausgesetzt um einen Pradiabetes auszulosen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgefuhrt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der Nuchternglukosewert in den weiblichen KO-Mausen leicht erhoht ist. Daher wurden die oGTT‘s in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle Mause eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60% erhoht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und fur immunhistologische Zwecke prapariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergroserte durchschnittliche Inselflache und eine erhohte durchschnittliche β-Zellflache der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen fuhrt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Pradiabetes beitragt. Eine mogliche verstarkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschliesen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell konnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems fur die Insulinausschuttung naher ergrunden und dadurch eventuell neue Therapieansatze fur Diabetes mellitus Typ 2 bringen.