Sondas fluorescentes na avaliação de espematozoides bovinos pré e pós-separação por gradientes de densidade

A membrana plasmatica (MP) e fundamental na sobrevivencia dos espermatozoides no trato reprodutivo da femea e na manutencao de sua capacidade fecundante, onde danos a esta estrutura podem interferir na homeostase celular, comprometendo a viabilidade do gameta. Desta forma, a previa avaliacao da integridade de membrana (IM) do semen congelado, pode ser uma importante aliada na selecao de reprodutores e protocolos de IA (inseminacao artificial), IATF (inseminacao artificial em tempo fixo), TE (transferencia de embrioes) ou FIV (fecundacao in vitro). Metodos de selecao espermatica como o de gradientes de densidade sao essenciais para que os espermatozoides adquiram capacidade fecundante antes da FIV, sendo a avaliacao da IM destas celulas uma excelente ferramenta para determinar sua eficacia. Diferentes tecnicas vem sendo utilizadas para a avaliacao da IM, como as que empregam corantes vitais, choque hiposmotico ou associacoes de diferentes sondas fluorescentes. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a utilizacao da associacao de duas sondas fluorescentes, o Iodeto de Propidio (IP) e Diacetato de Carboxifluoresceina (DIC) na determinacao da IM de espermatozoides bovinos antes a apos a separacao por gradientes de densidade de Percoll. Neste estudo foram examinadas 1000 celulas espermaticas oriundas do semen congelado de um touro Bos taurus. Para tanto, a palheta foi descongelada a 35°C por 20'', homogeneizada e submetida a separacao por gradientes de Mini Percoll (30, 60 e 90%). Para avaliar a IM as amostras de semen foram divididas em dois grupos: PrePercoll, referente a amostra coletada logo apos o descongelamento do semen e a PosPercoll, obtida logo apos a separacao espermatica por Percoll®. As amostras foram incubadas por 8 minutos em solucao contendo 1,7 mM de formaldeido + 7,3 µM de PI + 20 µM de DIC, sendo posteriormente avaliadas em microscopio de epifluorescencia em filtro com excitacao de 510-560 ᶯm. Foram considerados espermatozoides com IM aqueles que apresentaram coloracao verde em todos os compartimentos celulares, sendo os demais considerados espermatozoides com lesao de MP e classificados em cinco categorias conforme o local da lesao: Categoria 1: MP acrossomal, Categoria 2: MP, Categoria 3: MP e MP acrossomal, Categoria 4: MP mitocondrial e Categoria 5: todas as MP. Os dados foram analisados pelo teste qui quadrado (X2) com significância de 5%. Todos os espermatozoides apresentaram fluorescencia, sendo observado um maior indice de IM (87,4%) para os espermatozoides do PosPercoll quando comparado com o grupo PrePercoll (68%). A maioria das lesoes foi encontrada na categoria 2 (13 e 7%) e categoria 3 (18 e 4%) para os grupos Pre e Pos Percoll, respectivamente. Com base nestes resultados podemos concluir que a associacao de sondas fluorescentes utilizadas neste estudo e adequada para avaliacao de integridade de membrana de espermatozoides bovinos antes e depois da separacao por Percoll, permitindo identificar de forma precisa o local da lesao.