区分犬瘟热病毒Asia-I型野毒株及疫苗株的AS-PCR方法

犬瘟热是一种接触性传染病，可侵害免疫系统、呼吸系统、消化系统，甚至神经系统，导致全身性的病理变化，对宠物犬、毛皮动物等存在巨大威胁。目前常用的胶体金检测法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染。为建立一种高效准确的鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的检测方法，本试验对从武汉地区收集已确诊犬瘟热的6只犬分离得到的野毒株以及3株广泛使用的CDV疫苗株进行全基因组测序，从氨基酸水平和碱基水平比对分析后，确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。通过对H基因进行分型，发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型，而疫苗株Y2为America-Ⅰ型，疫苗株Y1和Y3均为America-Ⅱ型。对比179株Asia-Ⅰ型（6株野毒株样品+173株GenBank Asia-Ⅰ型）与3株疫苗株的CDV-H基因序列，采用AS-PCR技术（3'端错配）设计出1对能有效区分犬瘟热Asia-Ⅰ型野毒株和疫苗株的特异性引物，上游引物序列为5'-TTAAATGATAATGACATAGTG-3'，下游引物序列为5'-CCTGGCAAGGCAAGA-3'。结果显示该引物有较强的特异性，6株样品野毒株均可扩增出长894 bp的片段，疫苗株不能扩增，且野毒株的H基因上存在9个较为规律的碱基（氨基酸）变异位点，而疫苗株在第277位氨基酸上均为天冬酰胺，这些变异可能导致N-糖基化位点的增加，从而对犬瘟热病毒疫苗株的毒力产生影响。本研究建立的AS-PCR方法能有效区分犬瘟热疫苗和Asia-Ⅰ型野毒株。