米曲霉来源α-半乳糖苷酶基因 gal A 在毕赤酵母中的表达及其对豆浆中大豆寡糖的酶解效果

本试验旨在研究米曲霉来源α-半乳糖苷酶基因 gal A 在毕赤酵母中的表达及其对豆浆中大豆寡糖的酶解效果。以NCBI数据库中米曲霉来源α-半乳糖苷酶基因 gal A 的mRNA序列（GenBank登录号：XP_001817311.1）为依据，利用PCR扩增得到 gal A 基因并根据毕赤酵母使用密码子的偏好性优化基因序列，构建野生型和优化型毕赤酵母工程菌株，摇瓶发酵120 h，测定酶学性质。设置25和45℃ 2个温度，每个温度下各设置0.6、1.2和2.4 U 3个加酶量，用发酵得到的α-半乳糖苷酶酶解10 mL豆浆中的大豆寡糖。结果显示：该α-半乳糖苷酶基因 gal A 全长1 605 bp，不含内含子，编码534个氨基酸，诱导120 h后优化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性为1.952 U/mL，比野生型工程菌株提高了285%。发酵得到的α-半乳糖苷酶的最适pH为4.33，最适温度为55℃；在pH 3.00~8.00间稳定性良好，在55℃条件下保持40 min后残余α-半乳糖苷酶相对活性为60%；该酶对大部分金属离子具有抗性，但其被MnSO 4 抑制；以对硝基苯基-β- D -吡喃半乳糖苷（ p NPG）为底物时的酶动力学参数米氏常数（ K m ）为0.024 3 mol/L，最大反应速度（ V max ）为1.0×10 -7 mol/（L·s）。酶解试验结果显示，45℃下加酶量为2.4 U反应12 h后，大豆寡糖中棉籽糖的降解率为50.0%，水苏糖的降解率为31.9%。由此可见，本试验中生产的α-半乳糖苷酶对豆浆中的大豆寡糖有一定的降解作用。