Smad3WT、Smad3EPSM、Smad33S-A3种质粒稳转HepG2细胞株的建立与功能研究

目的建立Smad3WT、Smad3EPSM及Smad33S-A3种质粒稳转HepG2细胞株，探究单纯转染3种质粒及选择性上调pSmad3C、pSmad3L对HepG2细胞功能的影响。方法采用脂质体转染试剂盒将Smad3WT（野生型Smad3基因）、Smad3EPSM（Smad3L区磷酸化位点突变）、Smad33S-A（Smad3C区磷酸化位点突变）3种质粒转染至HepG2细胞中，经G418筛选阳性细胞，Westernblot法鉴定3种质粒稳转细胞株的转染效率。MTT法检测细胞增殖情况。流式细胞术检测细胞周期及凋亡。结果Western blot结果显示，转染相应质粒的HepG2细胞高表达目的蛋白，提示稳转细胞株构建成功。MTT结果显示，在缺乏TGF-β，刺激情况下，转染3种质粒后对HepG2细胞增殖几乎没有影响，TGF-β1能够诱导稳转细胞株的细胞增殖，且转染Smad3EPSM质粒的HepG2细胞，较未转染、转染Smad3WT或Smad33S-A质粒的HepG2细胞对TGF-β1诱导的细胞增殖反应减弱。细胞周期分析显示，TGF-β1刺激下，转染Smad3EPSM质粒组Gn／G、期细胞数明显增多，而转染Smad33S-A质粒组G2／M期细胞数增加明显。细胞凋亡检测显示，TGF-β1刺激下，较未转染和转染Smad3WT质粒组，转染Smad3EPSM质粒组细胞凋亡率明显增加，而转染Smad33S-A质粒组细胞凋亡率明显降低。结论成功建立Smad3WT、Smad3EPSM及Smad33S-A3种质粒稳转HepG2细胞株，为进一步探讨开发能够经由调控pSmad3C、pSmad3L的药物提供一定的基础。