Efecto Del IFN-γ en la inducción de Trampas Extracelulares de los Neutrófilos (NETs) en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica

INTRODUCCION: las celulas fagociticas emplean varios mecanismos moleculares para promover la destruccion de microorganismos en el hospedero. Recientemente se describio un nuevo mecanismo microbicida denominado Trampas Extracelulares de los Neutrofilos (NETs por sus siglas en ingles), el cual se propone que funciona induciendo activamente la liberacion de redes de cromatina y proteinas granulares hacia el medio extracelular, promoviendo la captura y posterior destruccion de microorganismos patogenos. Este mecanismo ha sido descrito como un proceso de muerte celular diferente a la necrosis o apoptosis. Las NETs se forman a traves de un mecanismo dependiente de la generacion de especies reactivas del oxigeno por parte del sistema NADPH oxidasa de los neutrofilos (PMNs). La Enfermedad Granulomatosa Cronica (EGC, OMIM #306400) es una inmunodeficiencia primaria caracterizada por una falla en la produccion de ROS debida a mutaciones en genes asociados a este sistema y recientemente se demostro que en estos pacientes no hay liberacion de NETs, lo cual sugiere que esto podria contribuir a la susceptibilidad a infecciones severas por ciertos patogenos. El uso del IFN-y recombinante (rIFNg) en pacientes con EGC es una terapia estandar que contribuye a la accion microbicida del PMN y reduce la susceptibilidad a las infecciones en estos pacientes, sin embargo no es claro el o los mecanismos moleculares mediante los cuales el IFN-y actua en los PMN. Se pretende determinar si el IFN-y tiene algun efecto sobre la produccion de NETs en neutrofilos de individuos sanos y de pacientes con EGC y si la produccion de estas estructuras se puede modular con diferentes estimulos sinteticos y microbianos. En el presente reporte describimos los avances en la estandarizacion de la produccion de NETs en PMN de individuos sanos y el efecto del IFNg en la produccion de estos. MATERIALES Y METODOS: se tomaron 5 ml de sangre periferica por puncion venosa en tubo con EDTA de controles sanos. De la muestra fueron separados los PMNs por gradiente de densidad (Polymorphprep TM Application sheet). 2x105 PMNs cultivados en RPMI a 37o C en 5% de Co2 (Invitrogen) y pre-estimulados con IFN-γ 100UI/ml fueron activados con PMA 25nM para la determinacion de ROS y NETs. La cuantificacion de ROS se hizo a traves de citometria de flujo con dihidrorodamina (DHR). La observacion de las NETs se hizo mediante ensayo cualitativo a traves de microscopia de fluorescencia convencional y la cuantificacion mediante fluorometria en un espectrofluorometro (Spectra Max Gemini – Molecular devices). En ambos casos se utiliza Sytox Green para la tincion del DNA. Como controles se utilizaron DPI 10 uM y DNAsa 100 UI/ml. RESULTADOS: el estimulo con IFN- γ no produjo por si mismo un aumento en la produccion de ROS, mientras que al hacer una pre-estimulo con IFN- γ y posterior activacion con PMA 25nM hay un incremento en el indice de estimulacion de los PMNs con respecto a los que solo tienen el estimulo con PMA 25 nM. Los neutrofilos activados con PMA 25 nM producen NETs a partir de 1 hora de estimulo. Al hacer un pre-estimulo de los PMNs con IFN- γ 100 hay un aumento en la produccion de NETs. CONCLUSION: estos resultados preliminares indican que el IFN- γ potencia tanto la produccion de ROS como la produccion de NETs en individuos sanos lo cual es promisorio a la hora de evaluar su efecto en los pacientes con EGC.