pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建标记有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（hTIMP-1）真核表达质粒pcDNA3.1/hTIMP-1- EGFP,并通过转染大鼠血管平滑肌细胞（SMCs）验证hTIMP-1的表达.方法将hTIMP-1及编码EGFP的互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列通过扩增、酶切、插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点,构建 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达质粒;应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入SMCs（pcDNA3.1/hTIMP-1- EGFP转染组）.应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法 （Western blotting）等方法检测hTIMP-1的表达情况;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性.用空质粒pcDNA3.1转染 SMCs（空质粒pcDNA3.1转染组）和未转染质粒的SMCs（未转染组）作为对照.结果 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组重组质粒转染SMCs后,SMCs生长受到抑制;转染24 h后在荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,SMCs出现646 bp目的基因;Western blotting检测显示,在转染后的血管SMCs中有hTIMP-1表达;明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2、MMP-9活性降低;与空质粒 pcDNA3.1转染组和未转染组比较差异有统计学意义（P＜0.05）. 结论 TIMP-1真核表达质粒的构建和在血管SMCs中的表达,为TIMP-1基因治疗的研究奠定了基础.