Sistema para la Adquisición, Almacenamiento y Análisis de Corrientes Iónicas Transmembrana.

El objetivo general del presente trabajo ha sido el diseno e implementacion de un sistema automatizado para el control del potencial de membrana y la adquisicion, almacenamiento, representacion en pantalla y analisis de corrientes ionicas generadas en la membrana de celulas mantenidas en cultivo. El sistema, construido sobre un ordenador personal, es de una gran rapidez y versatilidad y permite su adaptacion para el registro y medida en tiempo real de cualquier fenomeno celular que pueda convertirse en una senal electrica. El diseno e implementacion del sistema se ha llevado a cabo no solo para satisfacer los requerimientos tecnicos necesarios en la investigacion biofisica de nuestro laboratorio, sino que el desarrollo del "hardware" y "software" propios ha sido uno de los objetivos del trabajo. De esta forma se ha conseguido una independencia tecnologica y potenciado la calidad de la investigacion y la capacidad de analisis que son criticas para llevar a cabo una investigacion competitiva en biofisica celular. Los objetivos especificos del trabajo han sido los siguientes: 1) Diseno e implementacion de un generador de pulsos programable necesario para modificar el potencial de membrana con pulsos unicos o con secuencias de pulsos con intervalos variables y polaridad, amplitud y duracion seleccionables segun los requerimiento experimentales. 2). Diseno y construccion de un sistema de adquisicion basado en la conversion digital de las senales de corrientes ionicas transmembrana generadas por los cambios del potencial de membrana al aplicar los pulsos referidos en el parrafo anterior. La velocidad de adquisicion (de 20 a 200 µs por muestra) se modifica por programa y una secuencia de muestras (formada por 500 puntos cada uno con resolucion de 12 bits) se almacenan en memoria RAM del ordenador o en un disco duro. 3) Diseno y construccion de un sistema de conversion digital/analogico de secuencias de muestras almacenadas en RAM o en disco duro del ordenador para su representacion en la pantalla de un osciloscopio. Al generar el ordenador la senal de barrido del osciloscopio y representar la secuencia de muestras a una frecuencia superior a 20 Hz se convierte un osciloscopio normal en otro digital con una flexibilidad superior a los osciloscopios digitales existentes. Mediante un segundo canal del osciloscopio se presentan tambien en pantalla funciones matematicas (exponenciales, derivadas, etc.) generadas en el propio ordenador. 4) Desarrollo del programa ANALA, escrito en Basic y en Lenguaje Ensamblador, que controla los elementos del "hardware" indicados anteriormente y que almacena todas las variables experimentales. Mediante diferentes subrutinas este programa realiza el analisis de las senales almacenadas. El analisis se centra fundamentalmente en: medida automatica de parametros (amplitud, duracion, intervalos, etc); confeccion de diagramas para observar la relacion entre dos parametros; sustraccion y promediado de senales; ajuste lineal y exponencial de partes de la senal registrada; integracion y diferenciacion de la senal; medida automatica de capacidad y tamano de las celulas; calculo de la resistencia en serie. 5) Ajuste y comprobacion del funcionamiento de cada una de las partes del sistema t en su conjunto utilizando un circuito RC paralelo, equivalente desde el punto de vista electrico a la membrana celular, y el registro de corrientes de K+ en celulas adrenocorticales en cultivo mediante la tecnica de "patch-clamp".