ИНЖЕНЕРИЯ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ TRIGONOPSIS VARIABILIS: НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОСТАТКА PHE258

Природные оксидазы D-аминокислот (DAAO) обладают широким спектром субстратной специфичности и поэтому они непригодны для селективного определения отдельных D-аминокислот. Для получения DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) с более узкой специфичностью был проведен анализ трехмерной структуры фермента, который показал, что на поверхности белковой глобулы находится остаток Phe258, контролирующий вход субстратов в активный центр. Остаток Phe258 был заменен на остатки Ala, Ser и Tyr. Мутантные TvDAAO с заменами Phe258Ala, Phe258Ser и Phe258Tyr были очищены до гомогенного состоя- ния и были изучены их термостабильность и каталитические свойства. Введение вышеуказанных амино- кислотных замен приводит как к небольшой стабилизации (Phe258Tyr), так и дестабилизации фермента (Phe258Ser), причем изменение величины периода полуинактивации составляет не более двух раз. В то же время эти замены привели к резкому изменению спектра субстратной специфичности. Увеличение размера боковой группы за счет замены Phe258Tyr приводит к ухудшению каталитической эффективности практи- чески со всеми изученными D-аминокислотами. В случае двух других замен наблюдается резкое сужение спектра субстратной специфичности. Улучшение каталитической эффективности наблюдается только в случае D-Tyr, D-Phe и D-Leu, а для остальных D-аминокислот она, наоборот, резко снижается. Для TvDAAO Phe258Ala улучшение каталитической эффективности с D-Tyr, D-Phe и D-Leu составляет 3,66, 11,7 и 1,5 ра- за, а для мутантной TvDAAO Phe258Ser - 1,7, 4,75 и 6,61 соответственно.