Cinétique de traduction des ribosomes à l'échelle de la molécule unique par microscopie de fluorescence

Les ribosomes sont des moteurs moleculaires qui se deplacent le long des ARN messagers pour lire l'information genetique et synthetiser les proteines. La dynamique de ce processus de traduction est encore mal connue, notamment la facon dont le ribosome se deplace le long de l'ARN messager. Les ribosomes etant indispensables a toute forme de vie, une meilleure connaissance des mecanismes traductionnels pourrait aider a l'elaboration d'antibiotiques specifiques d'organismes pathogenes. Pouvoir observer la position de ribosomes individuels pendant le processus de traduction est donc un enjeu important. Dans nos experiences, nous developpons plusieurs methodes de marquage fluorescent pour pouvoir observer de facon efficace des ribosomes individuels se deplacant le long d'un ARNm. Dans les travaux presentes ici, nous posons des jalons fluorescents sur la sequence codante de l'ARNm, les departs des marqueurs signalant alors le passage des ribosomes a leurs emplacements. Notre montage experimental est base sur la microscopie de fluorescence en reflexion totale, et les complexes ARNm-ribosome sont donc fixes sur la lamelle de microscope afin d'etre eclaires par l'onde evanescente. Nous avons marque l'ARNm en l'hybridant a un oligonucleotide marque avec un fluorophore organique de type ATTO qui sera detectable au sein de l'onde evanescente. La chimie de surface utilisee pour cette accroche doit etre tres bien controlee pour ne pas fixer les complexes de facon non-specifique, ce qui risquerait de paralyser la traduction. Nous utilisons des surfaces couvertes de PEG sur lesquelles les ARNm sont fixes par l'intermediaire de liaisons biotine-streptavidine. Les ribosomes sont initialement immobilises sur l'ARNm puis suite a l'injection d'un systeme de traduction in-vitro, ils peuvent traduire la proteine et atteindre les oligonucleotides marques. Les ribosomes sont capables de les decrocher pour pouvoir poursuivre la traduction. Ces dissociations se traduisent par une disparition du signal de fluorescence des marqueurs puisqu'ils diffusent hors de l'onde evanescente. Nous avons ainsi pu observer la distribution des durees de traduction jusqu'a un endroit donne de l'ARN messager pour une population de ribosomes individuels. Un controle a ete effectue en bloquant les ribosomes a l'aide d'un antibiotique. Nous prevoyons de marquer l'ARNm avec deux fluorophores differents afin de detecter le passage du ribosome en deux endroits distincts. Nous devrions ainsi obtenir des statistiques plus precises sur la dynamique du ribosome.