LOH- und Expressionsanalysen zur Identifikation neuer prognostischer Marker in Wilms Tumoren

Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, zahlt zu den im Kindesalter am haufigsten auftretenden malignen Tumoren und entsteht meist unilateral (90 – 95 %) und sporadisch (98 – 99 %). Leider sind bis heute die molekularen Ursachen, die zur Entwicklung dieser Tumoren fuhren nur unzureichend aufgeklart. So werden bisher nur drei Gene mit dem Auftreten von WT in Verbindung gebracht: WT1, CTNNB1 und WTx. Wahrend WT1 und CTNNB1 jeweils Mutationsraten von etwa 10 – 15 % aufweisen, die zudem haufig gemeinsam vorliegen, werden fur WTx Mutationsraten von etwa 30 % beobachtet. Die genetischen Alterationen der anderen Tumoren sind noch immer komplett unbekannt. Ziel dieser Arbeit war aus diesem Grund die Identifikation von relevanten Regionen und Genen, die an der Entstehung bzw. dem klinischen Fortschreiten von Wilms Tumoren beteiligt sind. Zusatzlich sollten weitere Untersuchungen zur Einschatzung ihres prognostischen Potenzials dienen. In einem ersten Ansatz wurden die Chromosomenbereiche 11q und 16q in einer grosen Anzahl von Wilms Tumoren auf LOH (=loss of heterozygosity), d.h. den (partiellen) Verlust von genetischem Material, untersucht. In beiden Fallen wurden erhohte LOH-Raten von etwa 20 % beobachtet, jedoch war keine Eingrenzung der relevanten Regionen moglich, da Allelverluste nicht stets ab einem bestimmten Marker beobachtet wurden. Ein Vergleich mit der Histologie ergab signifikante Assoziationen der Allelverluste mit anaplastischen und Mischtyp-Tumoren (nur fur LOH 11q), wohingegen kaum LOHs in epithelialen und stromareichen Tumoren festgestellt wurden. Somit scheinen auf 11q und 16q Gene vorzuliegen, die einerseits die Differenzierung in Epithel und Stroma begunstigen oder andererseits ein blastemreiches und anaplastisches Erscheinungsbild verhindern. Jedoch konnte auch die Assoziation von bestimmten Subtypen mit LOH 11q und 16q auf eine Entstehung aus unterschiedlichen Zellen hindeuten. Weiterhin war das Auftreten von LOH, v.a. wenn jeweils der komplette Chromosomenarm betroffen war, mit einem erhohten Rezidiv- und Sterberisiko (nur LOH 11q) verbunden. Somit konnte gezeigt werden, dass LOH-Untersuchungen auf 11q und 16q zur Identifikation von Hochrisikopatienten fur die Entwicklung von Rezidiven bzw. erhohter Mortalitat eingesetzt werden konnen, wodurch eine individuelle Anpassung der Therapiemasnahmen ermoglicht wird. In einem zweiten Ansatz wurden eine Reihe von bereits publizierten potenziellen Markergenen in einer grosen Anzahl von Wilms Tumoren mit Hilfe der Realtime RT-PCR auf ihre Relevanz uberpruft. Allen diesen Genen wurde zuvor eine Funktion bei der histologischen Klassifikation der Tumoren bzw. bei der Vorhersage bestimmter klinischer Verlaufe zugeschrieben. Die univariate Analyse diente der Beurteilung der Relevanz einzelner Gene, wohingegen die multivariate Analyse zur Bestimmung von prognostischen Genkombinationen eingesetzt wurde. Anschliesend erfolgte die Validierung mittels eines zweiten und unabhangigen Tumorsatzes. Auch wenn viele der bereits publizierten Marker und in der ersten Analyse erhaltenen Assoziationen in einem weiteren und unabhangigen Tumorsatz nicht verifizierbar waren, konnten dennoch einige fruhere Ergebnisse repliziert und die Relevanz der entsprechenden Gene nachgewiesen werden. Neben der Verbindung der Repression von HEY2 und TRIM22 mit Hochrisikotumoren bzw. einer hoheren Sterbewahrscheinlichkeit fanden sich schwach signifikante Assoziationen auch fur die verminderte Expression von TRIM22 und VEGF mit der Histologie. Ebenso waren erhohte Level von TERT und die Repression von TRIM22 mit der Entwicklung eines Rezidivs verbunden. Vor allem aber die Korrelation der Repression von HEY2 und VEGF sowie einer Uberexpression von CA9 mit Rezidiven, Tumoren hoher Malignitat oder primaren Metastasen verweisen auf die Notwendigkeit, besonders die Hypoxie- und Angiogenese-Signalkaskaden in Wilms Tumoren zu untersuchen, um deren Einfluss v.a. auf das Fortschreiten und die Ausbreitung der Tumoren zu evaluieren. Auch wenn die multivariate Analyse nicht zu relevanten Genkombinationen fuhrte, konnte hier dennoch eine schwache Assoziation der verminderten Expression von TOP2A und TRIM22 mit primaren Metastasen oder einer erhohten Mortalitat, sowie der Uberexpression von TERT mit der Rezidivbildung bestatigt werden. Interessanterweise stellte sich die Histologie, die derzeit das Hauptkriterium fur die Risikoklassifikation darstellt, weder als geeigneter prognostischer Marker fur die Beurteilung des Rezidiv- noch des Sterberisikos heraus. Somit sollten Realtime RT-PCR Analysen in Zukunft als weiterer Faktor zur Beurteilung des Rezidiv- und Sterberisikos eingesetzt werden, um eine individuelle Anpassung der Therapie zu ermoglichen. Basierend auf den Ergebnissen der Realtime RT-PCR Analyse wurde der Einfluss der Expression ausgewahlter Gene auf Primarkulturen, die aus nativem Wilms Tumormaterial gewonnen wurden, untersucht. Nach der Uberexpression von HEY2, EGR1, MYCN und TRIM22 wurden bei allen Zellen hohe Sterberaten beobachtet, v.a. bei HEY2 und EGR1. Leider konnte weder fur HEY2 noch fur EGR1 der Grund hierfur aufgeklart werden, allerdings war bei EGR1 weder die Apoptose noch die Seneszenz beteiligt. Im Gegensatz hierzu wurde die Apoptose als entscheidender Mechanismus bei MYCN und v.a. TRIM22 ermittelt. Auserdem scheint bei MYCN ein groser Anteil an Zellen in die Seneszenz einzutreten. Auch wenn diese ersten Untersuchungen an Primarkulturen von Wilms Tumoren eindeutig die Relevanz dieser Gene fur die Entwicklung bzw. das Fortschreiten der Tumoren bestatigten, so sind trotz alledem weitere Experimente v.a. in einer groseren Anzahl genetisch unterschiedlicher Primarkulturen notig, um das endgultige Potenzial dieser Gene aufzuklaren.