Control de "Clostridium" spp. Y prevención de hinchazón tardía en queso mediante bacterias lácticas productoras de antimicrobianos, altas presiones y endolisinas fágicas/

La hinchazon tardia del queso, o fermentacion butirica, es una alteracion de origen microbiano que se produce en quesos curados y semicurados debido al crecimiento en el interior del queso de algunas especies del genero Clostridium capaces de fermentar el acido lactico con produccion de acido butirico, acido acetico, dioxido de carbono e hidrogeno. Como resultado se originan defectos de textura, aroma y sabor en el queso que imposibilitan su comercializacion. La adicion de nitratos o lisozima a la leche es empleada para el control de Clostridium, pero estos aditivos presentan ciertos riesgos sanitarios y, pese a su uso, los quesos se siguen hinchando. En esta Tesis Doctoral se ha evaluado el empleo de bacterias lacticas productoras de los antimicrobianos, nisina o reuterina, la aplicacion de altas presiones y el empleo de endolisinas fagicas como estrategias alternativas al uso de estos aditivos para prevenir la hinchazon tardia causada por Clostridium spp. en el queso. Ademas, se ha estudiado el efecto de las estrategias que resultaron eficaces sobre las caracteristicas microbiologicas, fisico quimicas y sensoriales del queso, y la aplicacion de endolisinas fagicas para detectar Clostridium spp. En primer lugar se estudio el grado de implicacion de distintas especies de Clostridium en la hinchazon tardia del queso. C. tyrobutyricum resulto ser un potente agente causal de la hinchazon tardia, si bien, otras especies de Clostridium tambien fueron capaces de producir hinchazon en queso, aunque en un grado mucho menor y en una etapa mas avanzada de la maduracion. C. tyrobutyricum presento un comportamiento diferente durante la elaboracion y maduracion de los quesos modelo y los de tamano real. En los primeros, germino y esporulo en distintos momentos de la maduracion. Sin embargo, en los quesos de tamano real C. tyrobutyricum fue capaz de germinar tempranamente, durante la etapa de prensado, y su tasa de esporulacion fue baja o inexistente durante la maduracion. De los antimicrobianos estudiados in vitro, la nisina y la reuterina presentaron un amplio espectro anticlostridium en RCM y leche, inhibiendo el crecimiento de las celulas vegetativas y esporas de todas las cepas de Clostridium ensayadas. Sin embargo, la nisina producida in situ por Lactococcus lactis subesp. lactis INIA 415 no previno la hinchazon tardia del queso causada por C. tyrobutyricum, retrasando la aparicion del defecto solo una semana. Por otro lado, la reuterina producida in situ por Lb. reuteri INIA P572 a partir de glicerol inhibio el crecimiento de C. tyrobutyricum y previno la aparicion de hinchazon del queso, sin perjudicar su calidad sensorial cuando el glicerol se anadio a la leche en concentraciones inferiores a 100 mM. El estudio del efecto de las altas presiones sobre la germinacion de esporas de C. tyrobutyricum fue limitado, ya que este microorganismo germino antes de la presurizacion. Probablemente debido a ello, la aplicacion de un solo ciclo de alta presion a 300 MPa fue suficiente para inactivar las celulas vegetativas de C. tyrobutyricum y evitar la hinchazon tardia del queso sin afectar a su calidad sensorial. La endolisina CTP1L, del bacteriofago virulento phi CTP1 de C. tyrobutyricum, presento un espectro de actividad litica practicamente restringido a la cepa huesped, siendo incapaz de lisar cepas de Clostridium aisladas de quesos con hinchazon. Sin embargo, su espectro de union fue amplio, con especificidad a nivel de genero y, ademas, la endolisina fue capaz de unirse a esporas de Clostridium. La aplicacion del domino de union C terminal de la endolisina CTP1L marcado con GFP permitio, por primera vez, la visualizacion in situ de las celulas vegetativas de C. tyrobutyricum en queso, y estudiar su evolucion y estado fisiologico mediante microscopia de contraste de fases y fluorescencia, revelando que las celulas vegetativas se lisan durante la maduracion, y confirmando la baja tasa de esporulacion de este microorganismo.