ETEC F4-F5融合基因表达及间接ELISA方法建立

表达产肠毒素性大肠杆菌（enterotoxigenicEstherichiacoli，ETEC）黏附素F4和F5融合蛋白，建立间接ELISA方法，旨在监测猪场ETEC感染以及疫苗免疫情况。根据GenBank中登录F4和F5基因序列，分析保守区，优化密码子，合成F4-F5串联基因，克隆入原核表达载体，表达重组蛋白His-F4-F5。以纯化的His-F4-F5蛋白作为检测抗原，建立检测ETEC抗体的间接EIISA方法。经酶切和DNA序列分析，成功构建重组菌Bl。21（pColdI-F4-F5），SDS～PAGE和Westernblot分析，融合表达F4F5相对分子质量为29000，与ETEC高免血清发生特异性反应，条带单一。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件：抗原包被浓度6ng／孔，待检血清稀释比例1：200，HRP羊抗猪二抗的工作浓度1：15000，5％脱脂奶封闭1h，底物作用时间15min。本研究建立F4-F5间接EI．ISA方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强的特点，是猪场ETEC感染和疫苗免疫效果检测的有效工具，进而指导疫苗使用和新型疫苗研发。