Qm/mm investigation of the reaction mechanism of the ns3/ns4a hepatitis c protease with its main substrates

La presente tesis doctoral se enmarca dentro del estudio de la reactividad enzimatica por metodos teoricos-computacionales. Por medio de la metodologia hibrida QM/MM (quantum mechanics/molecular mechanics) se ha caracterizado el mecanismo de reaccion de la etapa limitante de la velocidad de la proteasa NS3/NS4A del virus de la hepatitis C con sus tres principales sustratos naturales, los fragmentos de la poliproteina virica NS5A/5B, NS4B/5A y NS4A/4B. Asimismo, el empleo de correcciones con el metodo ab initio MP2 y de dinamica molecular con muestreos forzados (metodo Umbrella Sampling) permite obtener acuerdos cuasi cuantitativos entre las barreras calculadas y las barreras estimadas a partir de datos experimentales. Estas mismas tecnicas permiten tambien clarificar el papel que el residuo Arg-155 juega en la catalisis. En el primer capitulo se explica el marco biologico del sistema estudiado en esta tesis: Las enzimas y sus propiedades asi como el ciclo biologico del virus de la hepatits C y el papel prominente que la proteasa NS3/NS4A juega en el. En el segundo capitulo, se explican los fundamentos de la simulacion molecular partiendo desde los principios fisicos. Asi, se introducen los metodos cuanticos y la mecanica molecular como base necesaria para entender los metodos hibridos. Tambien se explica las tecnicas empleadas explorar la superficie de energia potencial, ya sea mediante optimizaciones geometricas como mediante dinamica molecular. Por ultimo, se detallan los metodos de termodinamica estadistica que permiten extrapolar resultados macroscopicos (como, p.e. energias libres de reaccion) a partir de los resultados microscopicos de las simulaciones. El tercer capitulo se dedica al primer estudio de la proteasa NS3/NS4A con su sustrato NS5A/5B. En el, se detalla la investigacion a nivel AM1/CHARMM de este sistema y las conclusiones obtenidas, siendo la mas prominente que el ataque nuclefilico al carbonilo del sustrato es la etapa limitante de la velocidad de reaccion. El cuarto capitulo versa sobre la eleccion del metodo empleado para realizar la particion QM/MM en caso de que sea necesario romper un enlace covalente. Se comparan las prestaciones de los metodos GHO (Generalized Hybrid Orbital) y Link Atom para la reaccion de la proteasa virica con el sustrato NS5A/5B y se razonan las diferencias obtenidas en cada caso. En el quinto capitulo se emplea el conocimiento obtenido en los dos anteriores para realizar el estudio completo de la reactividad de la proteasa NS3/NS4A con sus tres sustratos principales. Se realizan calculos de las superficies de energia potencial con correcciones MP2 y tambien se obtienen perfiles de energia libre, que, al ser tambien corregidos a nivel MP2, concuerdan en alto grado con las barreras estimadas a partir de datos experimentales. Por ultimo, mutando virtualmente la Arg-155 a Alanina, se obtiene una explicacion clara del papel jugado por este residuo en la catalisis e indica porque son viables algunas mutaciones de este residuo en el virus a otros aminoacidos voluminosos, concediendo asi resistencia a algunos inhibidores de proteasa. De todo esto, se extraen las siguientes conclusiones: ? Se confirma que la proteasa NS3/NS4A presenta un mecanismo similar al de la quimotripsina. ? La etapa de acilacion es la etapa limitante de la velocidad. ? Para que la comparacion con datos experimentales tenga sentido, es necesaria la inclusion de correcciones a nivel ab initio en los resultados AM1/MM, asi como considerar los efectos de la temperatura mediante calculos de energia libre. ? El metodo substractivo empleado en este trabajo para corregir las energias AM1/MM funciona de forma satisfactoria, lo que probablemente implica que la polarizacion de la region QM del sistema por parte de la region MM no difiere en gran medida segun se emplee el metodo AM1 o un metodo ab initio de nivel MP2 o similar. ? El esquema de particion QM-MM mas adecuado para este sistema es el basado en el metodo GHO, sin embargo, probablemente, la mejor opcion depende de cada sistema. Asi esto debe ser probado en cada caso que se desee investigar. ? Existen ciertas especifidades en el mecanismo de reaccion segun el sustrato que se trate, pero estas deberan ser investigadas con mayor profundidad en un futuro. ? El metodo QM/MM ha permitido clarificar el papel de la Arg-155 en el mecanismo de reaccion y sus implicaciones para entender el mecanismo de resistencia que ciertas mutaciones viricas presentan a algunos farmacos que tienen a la proteasa NS3/NS4A como diana. ? Se espera que investigaciones futuras lleven a posibles mejores farmacos a traves del diseno de analogos del estado de transicion, por lo que estos trabajos tendrian una vertiente mas aplicada.