Caracterização, imunodetecção e quantificação da expressão de proteínas relacionadas à patogenicidade de Xylella fastidiosa : Characterization, immunodetection and quantification of protein expression related to pathogenicity of Xylella fastidiosa

Interacoes planta-patogeno possuem uma ampla participacao de mecanismos moleculares que dirigem todo o processo de manutencao e disseminacao do patogeno em seu hospedeiro. X. fastidiosa e uma bacteria fitopatogenica com grande repercussao em importantes culturas agronomicas no mundo, como, por exemplo, na citricultura brasileira. Estudos acerca da compreensao dos mecanismos de patogenicidade de X. fastidiosa puderam ser melhor desenvolvidos apos o sequenciamento do seu genoma, gerando novas informacoes e questionamentos em relacao ao seu comportamento biologico e molecular. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar a funcao da proteina VapD, acronimo em ingles designado para virulence-associated protein D, produto da ORF XFb0051. Para tanto, foram utilizadas tecnicas de imunodeteccao por western blot para avaliacao da expressao da proteina nos diferentes estagios de desenvolvimento do biofilme de X. fastidiosa, alem de testes funcionais por meio de dicroismo circular com desenovelamento termico e testes de atividade de ribonuclease. Nossos resultados mostraram que VapD e uma proteina termoestavel com atividade de ribonuclease, com maior expressao nas fases de maturacao do biofilme, e de dispersao. Adicionalmente, VapD mostrou alta homologia estrutural com VapD de Helicobacter pylori. Simultaneamente foi realizado um estudo detalhado do perfil de secrecao in vitro de proteinas de X. fastidiosa em diferentes estagios de formacao do biofilme, e, adicionalmente, o perfil de secrecao apos ser submetida a uma dosagem subletal de tetraciclina, e tambem em meio contendo dosagem suplementar de calcio (II). Nossos resultados mostraram um aumento do numero de proteinas secretadas concomitante ao desenvolvimento do biofilme, podendo ser identificadas 50 proteinas na estirpe virulenta 9a5c e 48 na avirulenta J1a12, totalizando 74 diferentes proteinas em ambas as estirpes analisadas. Nao houve diferenca quantitativa sob uma dosagem subletal de tetraciclina, enquanto que sob uma suplementacao com calcio (II), houve consideravel aumento da formacao de biofilme e reducao drastica de proteinas secretadas. Os resultados obtidos neste trabalho agregam informacoes ineditas acerca do comportamento biologico e molecular de X. fastidiosa, gerando subsidios para uma maior investigacao referente ao seu complexo mecanismo de patogenicidade. Abstract