(alpha)-Glucan-Phosphorylasen aus Weizen (Triticum aestivum L.) Isolierung, Charakterisierung und Analyse der Expression

Pflanzliche a-Glucan-Phosphorylasen (EC 2.4.1.1) konnen Starke sowohl synthetisieren als auch abbauen. In Blattern und Kornern des Weizen var. Star konnen drei Phosphorylaseformen (P1, P2 und P3) mittels nicht-denaturierender Elektrophorese im Glycogen-haltigen Polyacrylamidgel unterschieden werden. Zwei der Formen (P1 und P2) sind cytosolische Enzyme, jedoch hat nur P1 die den cytosolischen Phosphorylasen eigene hohe Bindungsaffinitat zu verzweigten Polyglucanen. Die dritte Form (P3) ist plastidisch und zeigt die fur diesen Typ typische hohere katalytische Affinitat zu Maltooligosacchariden verglichen mit verzweigten Polyglucanen. In der vorliegenden Arbeit wurde die cytosolische Phosphorylase aus Weizen-blattern mittels einer Affinitatschromatographie an dem an Sepharose gekoppelten Aktivitatsinhibitor Cycloheptaamylose bis zur Homogenitat gereinigt. Die Phosphory-lase besteht aus einem Polypeptid, das nach denaturierender Polyacryl-amidgelelektrophorese ein Molekulargewicht von ca. 92 kD aufweist. Sie hat eine spezifische phosphorolytische Aktivitat von 57 U/mg Protein, was einer ca. 7000-fa-chen Anreicherung bei einer Ausbeute von 32 % entspricht. Da das Protein die bei-den Phosphorylaseformen P1 und P2 bildet, liegt es vermutlich in zwei verschiede-nen Formen vor, von denen eine eine Maskierung des Polyglucan-Bindungsbereichs aufweist. Die hochste Aktivitat hat die cytosolische Weizen-Phosphorylase, wie andere cytosolische Phosphorylasen, sowohl in der abbauenden als auch in der synthetisierenden Reaktion mit grosen, verzweigten Polyglucanen im Vergleich zu linearen Maltooligosacchariden als Substrat. Ihre katalytische Affinitat zu Amylopektin ist in der abbauenden Reaktion ca. 30mal hoher als zu Maltoheptaose, in der Synthesereaktion sogar ca. 150mal hoher. Die Umsatzgeschwindigkeiten mit verschiedenen Glucanen als Substrat sind in der Synthesereaktion vier- bis sieben-mal hoher als in der abbauenden Reaktion. Maltopentaose ist das kleinste Substrat, das abgebaut werden kann, wahrend Maltotetraose als Primer fur die Glu-cansynthese dienen kann. Das pH-Optimum der abbauenden Reaktion liegt mit pH 7,0 etwas hoher als das der Synthesereaktion (pH 6,0). Reduzierende Agenzien haben keinen Einfluss auf die Aktivitaten der cytosolischen Phosphorylase. Gegen das Protein der cytosolischen Phosphorylase wurden polyklonale Antikor-per hergestellt. Sie reagierten mit der gereinigten cytosolischen Phosphorylase und entsprechend grosen Polypeptiden in Weizenextrakten, nicht aber mit Proteinen von Extrakten, die nur plastidische Phosphorylase enthielten. In hoher Konzentration re-agierte das Serum im Westernblot-Verfahren auch mit anderen Proteinen von Wei-zenextrakten, schien aber in geeigneter Verdunnung spezifisch fur die cytosolische Phosphorylase zu sein. Aus einer cDNA-Bank aus jungen Weizenblattern wurde die cDNA einer cytosoli-schen Phosphorylase kloniert. Das erste Methionin (Met 20) der abgeleiteten Amino-sauresequenz des von Anfang an offenen Leserasters der cDNA stellt mit hochstwahrscheinlich den…