Single Closed-Tube Nested-PCR : un nouvel outil performant pour détecter Ralstonia solanacearum

RaIstonia solanacearum est l'agent responsable du fletrissement bacterien chez 55 familles botaniques differentes, dont les solanees. Cette bacteriose vasculaire, presente sur tous les continents, peut entrainer la destruction totale de la parcelle en production. Comme pour la plupart des phytobacterioses il n'existe pas de moyen de lutte curatif et les mesures prophylactiques ainsi que l'utilisation d'un materiel sain est a privilegier. Afin de repondre aux imperatifs de lutte preventive, il est indispensable de disposer d'un outil de detection specifique, sensible, utilisable pour la detection de la bacterie in planta et dans les sources potentielles de contamination, l'eau en particulier. Plusieurs outils de detection sont disponibles, mais aucun ne combine specificite et haute sensibilite, deux pre requis indispensables. Nous avons developpe une Nested-PCR a partir d'un fragment d'ADN de 282pb (1) qui amplifie specifiquement le complexe d'espece R. solanacearum (2). Pour limiter les risques de contaminations inherents a une PCR en deux etapes, une Nested-PCR en un seul tube a ete mise au point: Single Closed-Tube Nested-PCR (SCTN-PCR). La specificite de cet outil moleculaire a ete validee sur 16 especes bacteriennes, incluant R. pickettii, R. eutropha, Pseudomonas spp. ainsi que X. campestris pv. campestris. Quarante-quatre souches couvrant l'ensemble de la diversite genetique du complexe d'espece R. solanacearum (dont l'agent du BDB et R. syzygii) sont diagnostiquees par SCTN-PCR. Des plants de Hawai 7996, variete resistante a R. solanacearum, ont ete inocules par trempage des racines dans une suspension bacterienne a 107 cfu.mr-1 (souche reunionnaise JT519, phylotype I). La detection de R. solanacearum a ete mise en oeuvre par differentes methodes sur des tiges prelevees au cours du temps: detection par PCR simple (amorces Opina) ou par SCTN-PCR, directement sur broyat ou apres une extraction d'ADN a l'aide d'un kit d'extraction QUIAamp (Quiagen). Des comptages sont realises en parallele par etalement sur milieu semi-selectif. La detection la plus sensible est obtenue par SCTN-PCR, avec la detection de 100,1 cfu.mr-1 des six heures apres l'inoculation, soit plus de sept jours avant l'apparition de symptomes. Cette sensibilite remarquable de l'outil a permis de regrouper plusieurs echantillons afin de repondre aux contraintes d'efficacite de la certification. R. solanacearum est detecte dans un melange reunissant dix extraits d'ADN de tiges des le deuxieme jour apres inoculation. D'autre part, un protocole de preparation d'echantillons d'eau (3) a ete valide sur 12 differents types d'eaux d'irrigations a la Reunion: rivieres, nappes phreatiques, retenues collinaires et bassins. La sensibilite de la SCTN-PCR a ete testee sur ces eaux artificiellement contaminees de 100 a 106 cfu.ml-1. Sur les 3 repetitions effectuees pour les faibles concentrations, l'outil presente detecte au moins un des triplicats a partir de 103 cfu.ml-1. Des populations de 10 cfu.ml-1 sont detectees, mais de facon non reproductible pour des raisons evidentes liees a l'echantillonnage. Au cours d'une premiere validation sur le terrain, l'outil moleculaire a detecte R. solanacearum dans deux bassins provenant de regions infestees. Des etudes sont en cours afin de relier seuil de detection et quantite d'inoculum necessaire pour declencher une epidemie, ce qui est particulierement strategique dans le cas des cultures de type hors-sol. SCTN-PCR est sensible, specifique et rapide d'emploi. Les applications concernent le controle phytosanitaire, la certification ou l'epidemio-surveillance. Par ailleurs SCTN-PCR doit pouvoir etre adapte aux besoins de certification du materiel de propagation (vitroplants, semences...) d'autres especes hotes de R. solanacearum. (Texte integral)