衣原体蛋白酶样活性因子（CPAF）的克隆、表达及纯化

目的构建含衣原体蛋白酶样活性因子（CPAF）的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能。方法从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b（＋）连接,建立pET42b（＋）-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测。结果经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确。SDS-PAGE和West-ern印迹结果显示在70kD处呈现单一蛋白条带,pET42b（＋）-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右。结论经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础。