B-katerin ve Axin2 proteinleri etkileşimlerinin "Proksimiti Ligasyon Assay (Yakınsal Bağlanma Tespiti)" ile görüntülenmesi

Amac: Sinyal yolaklari ve proteinlerin fonksiyonel olarak derinlemesine calisilmasinin gerekliligi nedeni ile, proteomiks calismalarinda protein-protein etkilesimlerinin analizi her gecen gun daha da onemli hale gelmektedir. Proksimiti ligasyon assay (PLA), hucre ve doku kesitlerinde hucre ici proteinlerin ve protein interaksiyonlanmn kesfedilmesi amaci ile kullanilan yeni bir yontemdir. Bu calismada, PLA yontemini kullanarak, WNT sinyal ileti yolagi proteinlerinden aktive β-katenin ve Axin2 proteinlerinin etkilesimlerini bir T-hucreli akut lenfoblastik losemi (T-ALL) hucre hatti olan Jurkat hucrelerinde gostermeyi amacladik. Gerec ve Yontem: Jurkat hucreleri RPMT li besi yerinde yetistirilip lamlara fikse edilir. Gecirgen hale getirilen hucreler blokaj asamasindan ardindan birincil antikorlar ve PLA problan ile muamele edilirler. Hibridizasyon ve ligasyonunun ardindan sirkule oligonukleotidler, sirkule donen amplifikasyon (RCA) icin substrat olustururlar. RCA urunleri Texas Red isaretli problarin hibridizasyonu ile isaretlenir ve in situ PLA sinyalleri floresan mikroskobunda goruntulenir. Bulgular: Oncelikle hucre ici β-katenin and Axin2 protein ekspresyonlan belirlendi. Ardindan aktive β-katenin-Axin2 protein interaksiyon varligi hem nukleus hem de sitoplazmada gosterildi. Sonuc: Burada sunulan sonuclar, in situ PLA tekniginin, WNT yolagi uyelerinin birbirleri ile olan etkilesimlerinin hucresel boyutta tespit edilmesinde kullanilabilecegini gostermistir. Calismamizda, aktive β-katenin-Axin2 protein etkilesimini T-ALL hucre soyunda (Jurkat) gosterdik. Bu WNT sinyal yolaginin T-ALL de bozulmus regulasyonuna isaret ettigini goz onunde bulundurursak WNT yolagi elemanlari yeni tedavi protokolleri icin birer hedef molekul halini alabilirler.