Automatisation des mesures AFM pour des applications en biologie

Ces dernieres annees, le phenotype mecanique des cellules (tel que l'adhesion, l'elasticite, la rigidite), egalement connu sous le nom de proprietes mecaniques, s'est avere etre un identifiant valable pour distinguer les cellules saines des cellules malades. Les chercheurs du monde entier ont etabli un phenotype mecanique lie au cancer, aux maladies cardiovasculaires et aux maladies du sang, entre autres. La microscopie a force atomique (AFM) est la technique la plus utilisee pour mesurer les proprietes mecaniques et permet d'obtenir les proprietes a l'echelle nanometrique. Cependant, la manipulation de l'AFM requiert des competences techniques elevees et n'a pas ete concue pour les echantillons biologiques. Cependant, la possibilite d'analyser des echantillons dans l'air ou dans un liquide ces dernieres annees la rend plus attrayante pour le domaine du vivant. Cependant, avec les AFM actuels, il n'est pas evident d'analyser un nombre eleve de cellules ou de population cellulaire et il est ensuite difficile d'obtenir des resultats statistiques. Cette these de doctorat vise a resoudre le probleme du faible debit, une methodologie automatisee est proposee pour y parvenir. Cette methodologie est basee sur la combinaison de deux techniques : des reseaux de cellules et l'automatisation de l'AFM. Les mesures mecaniques sont effectuees automatiquement en executant un script developpe en Jython et les cellules sont immobilisees dans des positions connues permettant ainsi un plus grand nombre de mesures par rapport a ce qui a ete demontre jusqu'ici dans la litterature. Premierement, l'immobilisation est effectuee pour les microbes dans des timbres PDMS microfabriques et les cellules de mammiferes dans des reseaux de cellules commerciales (BIOSOFT et CYTOO). L'immobilisation est effectuee, dans le cas des microbes, en utilisant une technique d'assemblage convectif/capillaire atteignant un taux de remplissage d'environ 85 %. Et pour les cellules de mammiferes, la technique utilisee consiste a fixer la cellule sur une surface prealablement fonctionnalisee. Ensuite, l'AFM a ete modifie pour effectuer les mesures automatiquement. L'automatisation a ete realisee par le developpement d'un script ecrit en Jython et execute directement dans un BioAFM commercial (JPK Allemagne). Le script est polyvalent et peut etre adapte a plusieurs configurations d'echantillons. Le script execute un petit nombre d'indentations (9 ou 16) sur l'echantillon, en acquerant des courbes de force de differentes regions des cellules et en reduisant en meme temps le temps passe sur chaque cellule. Les resultats ont demontre que l'augmentation du nombre de cellules a un impact sur le nombre de mesures effectuees sur les cellules, et il est toujours possible d'obtenir des resultats comparables a ceux rapportes dans la litterature. Pour la premiere fois, l'analyse de la rigidite sur ~900 cellules de levure (C. albicans) est rapportee et met en evidence la presence de deux sous-populations. Nous avons compare des cellules de levure natives avec des cellules de levure traitees a la caspofongine. Les resultats ont ete obtenus en 4 h avec 9 indentations par cellule. Pour les cellules HeLa, la comparaison a ete faite entre les cellules HeLa natives et les cellules HeLa fixees. 80 cellules ont pu etre analysees en 30 minutes. Dans les deux cas (cellules de mammiferes et de levure), un decalage entre les cellules natives et les cellules traitees a ete observe, ce decalage est conforme a la litterature et prouve qu'il est possible de reduire le nombre d'indentations faites sur les cellules si le nombre de cellules analysees est eleve. Grâce a la quantite massive de donnees collectees, il a aussi ete possible d'utiliser l'apprentissage automatique, et les resultats preliminaires montrent qu'il est possible de distinguer les cellules natives des cellules traitees. La differenciation a ete faite en entrant les descripteurs : rigidite, adherence, et travail d'adhesion a l'algorithme d'apprentissage machine. Ce travail contribue a obtenir une signification statistique, ce qui est l'un des principaux inconvenients de l'analyse mecanique AFM et peut etre considere comme l'une des premieres etapes pour disposer d'un outil de diagnostic a partir du microscope a force atomique.