携带 FAT1-FAT2 基因打靶载体构建及其在猪肾细胞的表达与功能鉴定

目的 ω-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）对人类具有重要的营养价值与医疗作用。随着生物技术的发展，通过转基因技术可实现哺乳动物体内自身合成多不饱和脂肪酸，进而改变猪肉中不饱和脂肪酸的含量和种类，对人类的营养健康具有积极意义。 方法 克隆猪体内缺乏的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因FAT1和Δ-12脂肪酸去饱和酶的关键基因FAT2，构建携带FAT2-FAT2双基因的多位点打靶载体。该载体以猪rRNA基因间的内部转录间隔序列为靶位点；为提高定点整合效率，引入NEO、TK正负筛选系统进行双重选择；加入EGFP报告基因和Cre/Loxp系统，便于筛选阳性同源重组细胞克隆及后期删除筛选基因。将所构建的携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体，通过脂质体介导瞬时转染猪肾细胞PK15。 结果 RT-PCR结果显示，FAT2-FAT2双基因在猪肾细胞PK15中实现表达；脂肪酸测定结果显示，ω-6 PUFAs、ω-3PUFAs在对照组PN1（转染对照质粒PN1）、转染试验组PF1（转染携带FAT1基因）、转染试验组PF1F2（转染携带FAT2-FAT2双基因）中的含量分别为7.9%、7.03%、3.92% 和5.64%、7.01%、9.43%，差异均显著；ω-6/ω-3比例由对照组的1.4显著下降到试验组的0.42~1。 结论 构建携带FAT2-FAT2双基因的打靶载体转染猪肾细胞PK15可以表达产生FAT1-FAT2 mRNA，且可以显著提高转染细胞中ω-3 PUFAs的含量，为下一步生产转FAT2-FAT2双基因猪奠定基础。