CTX—M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶（extended—spectrum β-lactamase，ESBLs）进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法将保存的重组质粒pET-28a（＋）／CTX—M-3在大肠埃希菌BL21（DE3）中原核表达。IPTG诱导CTX—M-3融合蛋白表达，利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白，用纯化的CTX—M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果可溶性检测表明表达产物以可溶性形式（上清中）和包涵体形式（沉淀中）两种形式存在。通过蛋白表达条件的优化实验，SDS—PAGE电泳结果显示18℃，0．8mmol／LIPTG诱导24h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳。SDS-PAGE电泳和Western—blot检测表明获得纯化的重组32kD蛋白。免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1：32。结论pET-28a（＋）／CTX—M-3表达载体在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白，成功制备了效价较高的抗CTX—M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体。