Évaluation de l’exposition à un simulant de l’Ypérite grâce aux conjugués du glutathion et à un adduit de l’ADN

Objectifs L’yperite est un toxique de guerre appartenant a la famille des vesicants causant de graves brulures cutanees, possedant une toxicite oculaire, pulmonaire et systemique. En plus des effets aigues, cet agent entraine des consequences a long terme, physiques, psychiques, possedant un pouvoir carcinogene et mutagene. Aujourd’hui, il n’existe ni antidote ni traitement specifique ni marqueur d’exposition a l’yperite qui soit dose en routine comme preuve d’intoxication ou aidant a la prise en charge des intoxiques. Afin d’avoir une methode d’analyse fiable, les biomarqueurs d’expositions persistants et specifiques doivent etre valides. Methode Une premiere classe de marqueurs potentiels sont les dommages a l’ADN induits par addition de l’yperite sur les bases. Le 2-chloroethyl ethyl sulfure (CEES), l’analogue monofonctionnel de l’yperite, est egalement souvent utilise dans ces etudes car ils possedent une reactivite chimique tres proche. Les molecules electrophiles telles que l’yperite et le CEES se lient aussi a un tripeptide present en forte quantite dans les cellules, le glutathion. Ce dernier est metabolise successivement jusqu’a obtenir un derive de l’acide mercapturique (N-acetylcysteine), facilement eliminable par les urines. Pour evaluer la pertinence de ces metabolites comme biomarqueurs, des cellules, des explants de peau humaine et des souris ont ete exposes au CEES. Leur analyse est basee sur un couplage entre chromatographie liquide et spectrometrie de masse en mode tandem (UHPLC-MS/MS). La preparation de l’echantillon, basee sur l’extraction sur phase solide (solid phase extraction), se fait en ligne i.e. integree au systeme chromatographique. Resultats Grâce a la methode analytique developpee, nous avons pu quantifier l’adduit N7Guanine-CEES a la fois dans l’ADN et dans le milieu de culture de cellules HaCaT (lignee de keratinocyte) exposees au CEES. Les conjugues du glutathion (GSH-CEES) et de la cysteine (Cys-CEES) au CEES sont bien detectes dans le milieu de culture. Des experiences similaires faites sur des explants de peau humaine « fraiche » ont conduit aux memes resultats. Ces experiences in vitro montrent que les biomarqueurs choisis sont biologiquement pertinents puisque produits dans les cellules puis excretes dans le milieu extracellulaire. Des souris ont ete exposees par voie cutanee au CEES et sacrifiees jusqu’a 14 jours apres le traitement. Cette experience permet d’evaluer la persistance des metabolites dans un organisme. Dans le plasma, l’adduit N7Guanine-CEES et les conjugues Cys-CEES et N-Acetyl-Cysteine-CEES (NAC-CEES) ont ete detectes jusqu’a 14 jours apres l’exposition. A ce stade, en moyenne, la quantite de NAC-CEES est encore 12 fois superieure a la limite de detection. Conclusion A travers ces diverses experimentations biologiques, a la fois in vitro et in vivo, nous avons obtenus des resultats coherents permettant de conclure sur la pertinence des biomarqueurs etudies. L’adduit de l’ADN, N7Guanine-CEES, a ete detecte pour tous les modeles utilises. Dans le plasma, il est persistant jusqu’a 14 jours. GSH-CEES est ephemere et proche des limites de detection puisqu’il est rapidement transforme en CYS-CEES des qu’il est excrete par les cellules. La quantite de Cys-CEES est elevee par rapport aux autres biomarqueurs quel que soit le modele biologique mais son analyse est complexe de par son caractere polaire et la presence d’interferents. Ce conjugue est transforme en acide mercapturique essentiellement au niveau des reins et du foie. Ainsi, NAC-CEES n’a ete quantifie que lors de l’exposition animale. Il est cependant persistant pendant deux semaines avec une limite de detection de l’ordre de 17 fmol ce qui en fait un biomarqueur de choix. L’adaptation de cette methode analytique a l’yperite est en cours, avec de premiers resultats encourageants. A terme, l’approche pourrait permettre le diagnostic rapide de contaminations a l’yperite par un prelevement sanguin dried blood spot (DBS) sur le terrain suivi de la desorption integree au systeme SPE-UHPLC-MS/MS.