Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour des ARN interférent et des microRNA

Les petits ARN interferents (siRNA) sont encore rarement utilises chez les vertebres transgeniques pour inhiber l'expression de genes. En effet, les vecteurs contenant un promoteur de type ARN polymerase III comme ceux des genes U6 et H1 qui permettent une expression elevee des genes codant pour des ARNi dans des cellules sont souvent silencieux in vivo. Dans cette these, divers vecteurs exprimant des petits ARN double brins (shRNA) ont ete testes dans des cellules en culture et chez des souris transgeniques pour inhiber l'ARN m du gene precoce IE du virus de la pseudo rage porcine responsable de la maladie d'Aujeszky. La quantite et la sequence des si RNA produits ont ete etudiees par qPCR. Dans des cellules CHO transfectees pour une expression transitoire, les vecteurs contenant les genes U6-shRNA ont ete de loin les plus efficaces pour inhiber le gene IE en raison du niveau eleve de siRNA produit. Par ailleurs, deux constructions contenant le promoteur de type ARN polymerase II, le promoteur du gene eF1-α etune sequence de shRNA bordee par 5T ou introduite dans un gene de microARN (miRNA) le miR30 ont permis d'obtenir une inhibition significative mais limitee de l'ARNm du gene IE. Ceci parait etre du au niveau relativement faible de siRNA produit. Le siRNA produit par le gene du miRNA s'est avere aussi efficace que ceux obtenus a partir des constructions U6-shRNA bien que ces derniers soient un peu plus longs. Ces diverses constructions ont ete utilisees pour obtenir des souris transgeniques. Des souris contenant la sequence du shRNA n'ont pu etre obtenues qu'a partir de la construction miRNA. Ceci peut etre du au fait que les siRNA produits par les autres constructions ont exerce un effet inhibiteur sur des cibles aspecifiques (off-targeting) qui ne s'est pas produit avec le siRNA provenant de la construction miRNA car il contient quelques nucleotides en moins. Les souris transgeniques contenant la construction miRNA ont ete soumises a une infection par le virus de la pseudo rage porcine. Bien que les souris exprimaient le gene shRNA qu'a un faible niveau. Quelques souris transgeniques ont resiste a l'infection. La seconde partie de la these a consiste a selectionner d'autres sequences de shRNA capables d'inhiber l'expression du gene IE sans exercer des effets aspecifiques. Deux sequences de shRNA ont permis une telle inhibition. L'une est dirigee contre la region 5'UTR du gene IE et l'autre contre la region 3'UTR. Ces donnees suggerent que (1) l'efficacite d'un shRNA n'est pas determinee par sa sequence d'une maniere totalement previsible (2) l'efficacite d'un siRNA est d'autant plus eleve que sa sequence cible dans l'ARNm est en structure double brin (3) un effet inhibiteur intense et optimum peut etre obtenu avec des concentrations faibles d'un siRNA (4) les effets secondaires et en particulier le off-targeting peuvent avoir lieu a faible concentration du siRNA mais ils ont d'autant plus de chance de se produire que la concentration du si RNA est plus elevee (5) un siRNA destine a etre utilise chez des animaux transgeniques devrait etre choisi pour sa capacite a inhiber efficacement un gene a faible concentration pour reduire ses effets secondaires.