YB-1沉默点突变载体对YB-1基因敲除表型的回复

目的 Y盒结合蛋白-1（YB-1）在多种肿瘤中表达,并在转录和翻译水平调控相关癌基因中表达。为了进一步研究肺鳞癌细胞中YB-1的功能,构建了4个YB-1短发夹RNA（shRNA）干扰质粒pYr-1.1-YB-1-shRNA及YB-1沉默点突变质粒pYr-ads-1-YB-1 M。方法 pYr-1.1-YB-1-shRNA瞬时转染NIH293细胞,RT-PCR检测YB-1mRNA,筛选抑制效率最高的质粒,并稳定转染人肺鳞癌细胞株SK-MES-1,Western blot检测YB-1及PARP蛋白,免疫荧光检测核酸内切酶G（Endo G）亚细胞定位。针对干扰效率最高的靶序列,应用点突变PCR在YB-1基因表达质粒pYr-ads-1-YB-1上构建包含靶序列两个沉默点突变的质粒pYr-ads-1-YB-1 M。将pYr-1.1-YB-1-shRNA与pYr-ads-1-YB-1或pYr-ads-1-YB-1 M共转染SK-MES-1细胞,Western blot检测YB-1及PARP蛋白的表达。结果 4个pYr-1.1-YB-1-shRNA中2个干扰效率在60%以上,最高抑制率为70.3%;pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒稳定转染SK-MES-1细胞能有效抑制YB-1蛋白的表达,并促进PARP蛋白的剪切及Endo G蛋白易位入核;pYr-ads-1-YB-1 M能回复pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒所致的YB-1蛋白表达抑制,PARP蛋白剪切。结论 pYr-1.1-YB-1-shRNA特异性地通过抑制SK-MES-1细胞中YB-1的表达诱导细胞凋亡。