The EGF-like Modules of Anticoagulant Protein S. Studies of Ca2+ binding and module interactions

Popular Abstract in Swedish I samband med en karlskada startar en kaskad av reaktioner som leder fram till bildandet av ett blodkoagel. Det ar viktigt att bildandet av blodkoagel begransas till det skadade omradet. Blodkoagulationen ar darfor reglerad av antal antikoagulanta system av vilka det viktigaste ar protein C systemet. I detta system samverkar aktivt protein C (APC) tillsammans med ett annat protein, kallat protein S. En brist pa endera av dess tva proteiner medfor en okad risk att drabbas av blodpropp. Protein S ar uppbyggt av fyra olika regioner, s. k. moduler (schematiskt illustrerad i figur 5 pa sidan 22). Den forsta modulen innehaller karboxylerade glutaminsyror (Gla), en speciell aminosyra som kraver vitamin K for att bildas. Gla- modulen ansvarar for bindningen av protein S till de negativt laddade ytor som exponeras pa blodplattar (trombocyter) och cellmembraner fran skadade celler. Nasta del av molekylen bestar av den thrombin kansliga delen. Protein S kan har klyvas av thrombin, ett enzym i blodet som framjar koagulationen. En klyvning i denna region medfor att protein S ej langre kan fungera som hammare av blodkoagulationen. Den tredje regionen bestar av fyra moduler som var och en liknar den epidermala tillvaxtfaktorn (EGF). EGF ar ett litet protein som stimulerar differentieringen av vissa celltyper, en egenskap som saknas hos de EGF-lika modulerna i protein S. I de fyra EGF-lika modulerna finns ytterligare modifierade aminosyror, b-hydroxyasparagin (Hyn) och b-hydroxyaspartat (Hya). Den fjarde och sista delen av proteinet bestar av en modul som kallas for SHBG-delen och som liknar ett protein i kroppen som heter SHBG ‘sex hormone binding globulin‘. SHBG fungerar som transportprotein for manligt konshormon i blodet. Nagon liknade funktion av SHBG-delen i protein S har ej dokumenterats. Daremot ar denna del involverad i bindningen till ett annat protein, C4b-bindande protein (forkortat C4BP), vilket ar en del av kroppens immunforsvar. I blodet cirkulerar 30-40 % av protein S som fria molekyler medan resterande 60-70 % aterfinns bundna till C4BP. Endast den delen av protein S som cirkulerar som fria molekyler fungerar som koagulationshammare, dvs de 60-70 % som befinner sig i komplex med C4BP paverkar ej koagulationen. Denna avhandling behandlar framforallt EGF-modulernas kalciumbindande formaga och deras delaktighet i interaktioner mellan protein S och andra proteiner i blodkoagulationen. For att kunna studerea detta isolerades de EGF-lika modulerna i protein S antingen var for sig eller i kombination. De ensamma modulerna EGF 3 och 4 syntetiserades kemiskt och veckades till en nativ konformation. Med hjalp av baculovirus i insektceller producerades EGF 1-4, EGF 1-3, EGF 2-3 och EGF 2-4. Dessa protein fragment karakteriserades med avseende pa konformation, renhet och Hya/Hyn-innehall. Da insektcellerna ej kunde vecka EGF 3-4, producerades detta par i bakterier varefter modulerna veckades till nativ konformation. For att bestamma kalciumaffiniteten hos de enskilda modulerna och de EGF innehallande fragmenten anvandes NMR-teknik (karnmagnetisk resonans) samt metoder som utnyttjar kromofora kelatorer. Detta har gjort det mojligt att vis att de ensamma EGF-lika modulerna 3 och 4 i protein S innehaller var sitt kalciumbindande site (ung. stalle, ficka) med relativ svag affinitet. Kalciumaffiniteten ar i samma styrka som tidigare har dokumenterats for ensamma EGF-lika moduler fran andra koagulationsproteiner. Nar kalciumaffiniteten studerades i EGF 3-4 paret visade det sig daremot att affiniteten i det C-terminala sitet (slutet av molekylen, i detta fall EGF 4) hade okat 8600 ggr jamfort med affiniteten i den ensamma modulen. Det kalciumbindande sitet i EGF 3 binder dock med samma affinitet i paret och som ensam modul. Darmed framgar det att den huvudsakliga effekten pa kalciumbindning skapas av modulen N-terminalt (framfor) om den som binder. Nar EGF 1-4 och 2-4 undersoktes fann jag bl.a. att dessa fragment innehaller tva mycket hogaffina kalciumbindande site, med 1000-100 000 ggr hogre affinitet for kalcium an motsvarande ensamma EGF-lika moduler. Dessa tva site tros befinna sig i modul 3 och 4. Om EGF 4 daremot saknas, sasom i fragment EGF 1-3 och 2-3, uteblir den mycket hoga kalciumaffiniteten i EGF 3. EGF 4 tycks saledes ha den hogsta kalciumaffiniteten och den paverkar affiniteten i EGF 3 med en faktor av ~230 och EGF 2 med en faktor av ~25. Detta tyder pa att ocksa moduler C-terminalt (efter) om den kalciumbindande modulen paverkar kalciumaffiniteten. Fragmenten utnyttjades ocksa for att studera om och i sa fall vilka av de EGF-like modulerna i protein S som ar involverade i interaktionen med APC. Med hjalp av en metod som registrerar hur lang tid det tar for plasma att koagulera, studerades fragmentens formaga att tranga undan bindningen mellan protein S och APC. Endast de fragment som inneholl EGF 1 hade formagan att paverka interaktionen. EGF 1-4 hade dessutom en 10 ggr starkare inhibitorisk effekt an EGF 1-3. Det tyder antingen pa att det finns en svag interaktion mellan EGF 4 och APC eller att EGF 4 behovs for att halla EGF 1 i en optimal konformation for interaktion med APC. Da en antikoagulant aktivitet, oberoende av APC, tidigare hade foreslagits for protein S anvandes fragmenten och de ensamma modulerna aven for att studera en eventuell interaktion mellan protein S och faktor X (ett av de prokoagulanta proteinerna). I ett fast fas system lyckades alla EGF fragmenten utkonkurrera intakt protein S i dess interaktion med faktor X, medan ingen paverkan kunde pavisas med de ensamma modulerna. Ej heller sags nagon effekt av felveckat EGF 3-4 eller av ett kalciumbindande EGF modulpar fran ett orelaterat protein. Den fysiologiska relevansen av en protein S-faktor X interaktion ar dock fortfarande oklar. De kalciumbindande studierna liksom experimenten dar interaktionerna mellan protein S och andra proteiner studerades indikerade att modul-modul interaktioner ar viktiga for den biologiska funktionen av protein S. (Less)