Quest for peptidase activity modifiers : benefits of kinetic strategies

Peptidasen sind fur die physiologische Aktivierung und den Umsatz von Proteinen unabdingbar. Jedoch konnen sie in der extrazellularen Matrix der naturlichen Kontrolle entkommen und in der Folge fur den Organismus schadlich wirken. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Interaktions- mechanismen zwischen Peptidasen und ihren Modifiern unter Miteinbezug der auffalligen Mikroumgebung bestehend aus Zellen, Enzymen, Inhibitoren und Aktivatoren. Die Unloslichkeit der das Bindegewebe aufbauen extrazellularen Bestandteile, ist ein zentraler Punkt innerhalb der pharmakologischen Handhabung von pathologischen Peptidasen. Deshalb werden bei Untersuchungen von Pep- tidasen geeignete Werkzeuge benotigt. Bisher wurde der kinetische Mech- anismus einer Enzyminhibition trotz seiner Wichtigkeit in pharmakologis- chen Anwendungen nur geringfugig in die Analysen miteinbezogen. Je- doch kann die Zuordnung eines Modifiers zu seinem Inhibitions-/Aktivations- mechanismus durch sorgfaltige in vitro Messungen unterstutzend bei der Interpretation von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Proble- men wirken. Wir fuhrten eine systematische Neubeurteilung von Inaktivatoren durch unter Benutzung von Acetylcholinesterase als Modellenzym. In Anbetracht einer umfangreichen Kollektion von haufigen und seltenen Mechanismen stellten wir diagnostische Werkzeuge fur die Modelldiskriminierung auf, die anhand praktischer Beispiele getested und validiert wurden. Herkommliche kompetitive Inhibitoren, die sogenannte ’warheads’ gerichtet gegen das aktive Zentrum einer extrazellularen Matrix abbauenden Peptidase tragen, konnen ernsthafte Schwierigkeiten in der Erreichung und effektiven Kontrolle ihrer Targets erfahren. Der Grund liegt in der sehr starken An- bindung der Enzyme an ihre unloslichen Substrate von denen sie wahrend ihrer Zeit im Gewebe praktisch nicht weg dissoziieren. Wir identifizierten ein Molekul das ausserhalb der aktiven Stelle von Cathepsin B bindet und die Flexibilitat eines strukturellen Schlusselelementes, verantwortlich fur die Exo- und Endopeptidaseaktivitat des Enzyms, kontrolliert. Solche und ahn- liche Inhibitoren welche konstruierte Strukturen besitzen die ausserhalb der VI | aktiven Stelle eines Enzyms binden auch wenn dieses fest an ein Substrat gebunden ist, reprasentieren wertvolle Kantidaten fur die pharmakologische Kontrolle von pathologischen Peptidasen. Kunstlich hergestellte Modifier welche ausserhalb des aktiven Zentrums eines Enzyms binden, konnen mit den naturlich vorkommenden Inhibitoren wie auch unspezifischen Liganden, z.B. Komponeten der extrazellularen Matrix, in Wechselwirkung treten. Wir arbeiteten ein kinetischen Modell aus um die doppelte Interaktion zwischen Modifiern und Enzymen zu beschreiben, was in der Vorhersage von ’Synergy’, ’Zero-Interaction’ und ’Antagonism’ zwischen Inhibitoren und/oder Aktivatoren benutzt werden kann, wie auch fur die nicht-lineare Regressionsanalyse von experimentellen Daten. Gewohliche, ungewohnliche aber auch sonderbare Effekte hervorgerufen durch die Kombination von zwei Modifiern, wie beispielsweise die Reaktivierung bei hoher Modifierkonzentration nach einer unsprunglichen Inhibition bei tiefen Modifierkonzentration, konnen quantitativ durch die Zuhilfenahme von einfach zu benutzenden kinetischen Gleichungen interpretiert werden. Die theoretische Behandlung konnte fur die Interpretation der ratselhaften Resultate eingesetzt werden, welche sich bei der Interaktion von Elastase-2 mit Glykosaminoglykanen zeigten. Summary Peptidases are indispensable for physiological activation and turnover of pro- teins but in the extracellular space they may escape control and be harmful to the organism. This thesis focuses on the mechanism of interaction between peptidases and modifiers taking into account the peculiar microenvironment concerned with cells, enzymes, inhibitors and activators. The insoluble nature of extracellular matrix components, which build up connective tissues, is a central point in the pharmacological management of pathological peptidases, for which adequate investigation tools are nec- essary. The kinetic mechanism of inhibition of enzyme modifiers designed for pharmacological applications has been considered so far only marginally but is nevertheless of paramount importance. Indeed, ascribing modifiers to their correct inhibition/activation category by kinetic studies carefully per- formed in vitro, provide support to the interpretation of pharmacokinetic and pharmacodynamic issues. We performed a systematic re-evaluation of enzyme inactivators using acetyl- cholinesterase as a model enzyme. Considering a comprehensive collection of common and rare mechanisms of action, we set up diagnostic tools for model discrimination, which were tested and validated with practical examples. Conventional, competitive inhibitors carrying warheads directed to the active center of extracellular matrix degrading peptidases may experience serious difficulties in reaching and effectively controlling their targets. This occurs because the enzymes are tightly bound to their insoluble substrates and vir- tually do not detach during their permanence in the tissues. We identified a compound that binds outside the catalytic center of cathepsin B and con- trols the flexibility of a key structural element, which is responsible for the exo- and endopeptidase activity of the enzyme. This and similar inhibitors possessing engineered structures that bind to accessible sites of the target enzymes, even when these are tightly bound to their substrates, represent valuable candidates for the pharmacological control of pathological pepti- dases. IV | Summary Artificially designed modifiers target outside the active site of enzymes may be engaged in multiple interactions with naturally occurring inhibitors as well as with unspecific ligands such as components of the extracellular ma- trix. We elaborated a kinetic model for describing double interaction between modifiers and enzymes, which assists in making predictions of synergy, zero- interaction and antagonism between inhibitors and/or activators and can be used for non-linear regression analysis of experimental data as well. Ordinary, uncommon and even bizarre effects brought about by the combi- nation of two modifiers, such as reactivation at high effector concentration following inhibition at low concentration, can be quantitatively interpreted with the aid of easy-to-use kinetic equations. The theoretical treatment could be used for interpreting puzzling results obtained with elastase-2 in interaction with sulfated glycosaminoglycans.