Genotyp-Phänotyp Charakterisierung und Genexpressionsuntersuchungen bei familiären multiplen Exostosen (HME) sowie Funktionsanalysen von Missense-Mutationen im humanen MMR-Protein hMLH1 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
2009
Genomische Stabilitat ist vom Einzeller bis hin zum Menschen von groser Bedeutung.
Die Reparaturmechanismen einer Zelle sorgen fur den kontinuierlichen Erhalt der genomischen
Stabilitat. Genetische Veranderungen konnen unter anderem zur Entstehung von Krebs fuhren. Um dies zu verhindern, gibt es teilweise evolutionar hoch konservierte Mechanismen, die die Zellen vor Mutationen schutzen. Die DNA-Fehlpaarungsreparatur ist einer dieser Mechanismen, die von Prokaryoten bis hin zum Menschen konserviert ist und postreplikativ fehlgepaarte DNA repariert. Keimbahnmutationen in Fehlpaarungsreparaturgenen fuhren u. a. zu einer erhohten Anfalligkeit fur Dickdarmkrebs. Dieses Krankheitsbild wird als HNPCC (Hereditary non-polyposis colorectal cancer) oder auch als Lynch-Syndrom bezeichnet. In HNPCC-Patienten werden in ungefahr 30 % der Falle Missense-Mutationen gefunden, die zum Einbau einer veranderten Aminosaure in einem Fehlpaarungs-Reparaturprotein fuhren und dessen Einfluss auf die Funktion des Proteins nicht vorherzusagen ist. Eine funktionelle Analyse solcher Mutationen ist also von groser Wichtigkeit. Als Modellorganismus fur diese Analyse diente aufgrund der hohen evolutionaren Konservierung die Hefe Saccharomyces cerevisiae. In dieser Arbeit wurden 17 Missense-Mutationen aus HNPCC-Patienten in die ATP-Bindungs- und die hPMS2-Interaktionsdomane des humanen Fehlpaarungs-Reparaturgens hMLH1 eingefuhrt und im Hefe-2-Hybrid-System mit seinem Komplexpartner hPMS2 untersucht. Fur 8 Allele aus der ATPase-Domane wurden die Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen quantitativ uberpruft. Diese wurden zudem im dominant-negativen Mutatorphanotyp-Assay auf die Storung der Hefe-Fehlpaarungsreparatur durch die Expression der hMLH1-Allele hin untersucht. Zur Bestimmung der Mutationsrate wurde das in Hefe bestehende LYS2A14-Testsystem verwendet. Fur eine abschliesende Beurteilung der Funktionalitat von Allelen wurde ihre Proteinmenge bestimmt. Drei der untersuchten Missense-Mutationen im Bereich der ATPase-Domane wurden als pathogen eingestuft. Die restlichen 5 Allele konnten nicht mit Bestimmtheit als pathogen eingestuft werden, zeigen aber einen deutliche Tendenz in diese Richtung. Ein weiterer Bereich dieser Arbeit beschaftigte sich mit der Untersuchung von Familien, die an der Erkrankung der multiple hereditaren Osteochondrome (MO) leiden. MO ist eine dominant vererbte Krankheit mit einer Haufigkeit von 1:50 000. Bei Osteochondromen handelt es sich um Auswuchse an den langen Rohrenknochen. Wahrend der Hauptwachstumsphase in der Kindheit bis zur Pubertat besitzen sie ihre groste Wachstumsaktivitat.
In dieser Arbeit wurde unter anderem der Zusammenhang zwischen Genort und Auspragung der Erkrankung untersucht. Hierzu wurden 12 Familien einer sogenannten Kopplungsanalyse unterzogen und mittels Mikrosatellitenmarkern wurde der Genort eingeschrankt. Anschliesend wurde eine Mutationsanalyse des identifizierten Genortes mittels DHPLC-Analyse durchgefuhrt. In Erhebungsbogen wurden klinische Daten der betroffenen Personen dokumentiert und mit den Ergebnissen dieser Arbeit verglichen, um Aussagen zu einer Genotyp-/Phanotypkorrelation machen zu konnen. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Schwere der Erkrankung und dem betroffenen Genort hergestellt werden. Demnach sind EXT1-Patienten haufig schwerer betroffen als EXT2-Patienten. Weiterhin konnte ein Zusammenhang zwischen dem Verhaltnis der Ulnalange zur Grose eines Patienten und dem Genort EXT1 hergestellt werden. Dieser Parameter kann in der klinischen Diagnostik Anwendung finden, da nun nach der Bestimmung des Verhaltnisses Ulnalange zu Patientengrose eine Vorauswahl getroffen werden kann, welches Gen als erstes in die molekulare diagnostische Untersuchung eingeht. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Versuch, Aussagen uber die molekularen Unterschiede zwischen Osteochondromen und normalem Knorpelgewebe zu machen. Die Gene EXT1 und 2 kodieren Glycosyltransferasen, welche die Verlangerung der Polysaccharidkette Heparansulfat steuern. Uber die Wirkung der Gene auf die Signalwege der Chondrozytendifferenzierung und
insbesondere die Frage, auf welche Weise Mutationen der EXT-Gene zu Exostosen fuhren konnen, ist jedoch noch wenig bekannt. Molekulare Untersuchungen sollten deshalb einen moglichst breiten Uberblick uber die Stoffwechselbesonderheiten von Osteochondromzellen liefern. Hierzu wurden aus Tumorgewebe adharente Primarzellkulturen angelegt und in Arrayuntersuchungen die Genexpression analysiert. Der Vergleich der Transkription von Tumorzellkulturen mit normalen Knorpelkulturen zeigte Expressionsunterschiede von Genen, die in Zusammenhang mit der Entwicklung von Knorpelgewebe gebracht werden konnen. Die hoch- oder herunter regulierten Gene wurden mittels quantitativer real-time PCR untersucht. In den Tumorzelllinien herunter reguliert waren u. a. die Gene Decorin, Cathepsin D, Kollagen Typ 12, Metalloprotease 2 (MM2) und IHH. Hochreguliert waren Cyclin D1 und PTHrP. Diese Gene sind in Signalwegen der Chondrozytendifferenzierung involviert oder Bestandteil der Extrazelllularmatrix im Knorpel. EXT1 zeigte weder bei der Arrayuntersuchung noch bei der quantitativen real-time-PCR Expressionsunterschiede.
Keywords:
- Correction
- Source
- Cite
- Save
- Machine Reading By IdeaReader
0
References
0
Citations
NaN
KQI